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Rôle des éosinophiles dans la régulation des populations d'Haemonchus contortus chez le mouton

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Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
N° d'ordre : ……….. THESE Présentée Pour obtenir LE TITRE DE DOCTEUR DE L'INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE École doctorale : SCIENCES ECOLOGIQUES, VETERINAIRES, AGRONOMIQUES ET BIOINGENIERIES Spécialité : Qualité et Sécurité des Aliments Par M. Getachew TEREFE Titre de la thèse : Rôle des éosinophiles dans la régulation des populations d'Haemonchus contortus chez le mouton. Soutenue le 11 juin 2007 devant le jury composé de : Professeur Alain MILON Président Docteur Philippe JACQUIET Directeur de thèse Docteur Odile BAIN Rapporteur Professeur Allal DAKKAK Rapporteur Professeur Philippe DORCHIES Membre Professeur Jimmy DUNCAN Membre Professeur Jean-François MAGNAVAL Membre Docteur Isabelle OSWALD Membre

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  • research station

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Published 01 June 2007
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Language English
Document size 3 MB

N° d’ordre : ………..




THESE

Présentée
Pour obtenir

LE TITRE DE DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE

École doctorale : SCIENCES ECOLOGIQUES, VETERINAIRES, AGRONOMIQUES ET BIOINGENIERIES

Spécialité : Qualité et Sécurité des Aliments

Par M. Getachew TEREFE

Titre de la thèse : Rôle des éosinophiles dans la régulation des populations d’Haemonchus
contortus chez le mouton.


Soutenue le 11 juin 2007 devant le jury composé de :

Professeur Alain MILON Président
Docteur Philippe JACQUIET Directeur de thèse
Docteur Odile BAIN Rapporteur
Professeur Allal DAKKAK
Professeur Philippe DORCHIES Membre
Professeur Jimmy DUNCAN Membre
Professeur Jean-François MAGNAVAL Membre
Docteur Isabelle OSWALD Membre

ACKNOWLEDGMENTS


At the outset, I would like to express my appreciation to Dr. Philippe JACQUIET for his
advice during my doctoral research endeavour for the past three years. As my supervisor, his
observations and comments helped me to establish the overall direction of the research and to
move forward with investigation in depth. I benefited immensely from our discussions and
from the enormous encouragements he extended to me.

I also like to express my deepest gratitude to Professor Philippe DORCHIES for his help
in securing the French Government Scholarship and for organizing a very interesting
scientific environment. Moreover, I appreciated the many discussions I had with him in which
he was full of ideas and his encouragement and advice that motivated me to work hard.

I am greatly indebted to Dr. Christelle GRISEZ, François PREVOT, Jean-Paul
BERGAUD, Drs. Caroline LACROUX and Gilles FOUCRAS for excellent technical
assistance and for our pleasant collaboration.

It is a great pleasure to thank the President of the jury (also Director of Ecole National
Vétérinaire de Toulouse), Prof. Alain MILON, the Rapporteurs, Prof. Allal DAKKAK and
Dr. Odile BAIN and the jury members, Dr. Isabelle OSWALD, Profs. Philippe DORCHIES,
Jimmy DUNCAN and Jean-François MAGNAVAL for their kind willingness to referee this
thesis and to take part in the examination committee. Profs. Ph. DORCHIES and J. DUNCAN
were members of the external examiners board when I publicly defended my DVM thesis at
Debre Zeit (Ethiopia) in 1993. I am happy to see them again as jury members while I defend
my Doctoral thesis.

I would like to thank the Embassy of France in Ethiopia for providing me with the French
Government Scholarship (Bourse du Gouvernement Français), and CROUS-Toulouse for
facilitating my stay in France.

1 Thanks are also due to members of the thesis committee: Dr. G. FOUCRAS, Dr. I.
OSWALD and Prof. Ph. DORCHIES for forwarding valuable comments and suggestions that
enabled us to refine our experimental approaches.

My heartfelt acknowledgement also goes to the INRA research station (domaine INRA de
la Sapinière (Cher)) for providing us with most of the experimental animals that have been
used throughout our studies, and the Director of the INRA research unit (UMR 1225,
Interaction hôtes-agentes pathogènes), F. SCHELCHER, for allowing me to work with the
UMR research team.

I thank MC. FLUMIAN and C. BLEURT from the Department of Anatomy and
Pathology for their help with histological preparations, and M. SARDA, C.
FABREGUETTES, JM. DELMAS, C. BERNAD, C. ESPIE (ENVT) and M. LACOSTE
(INP-Toulouse), who have been kind enough to help in their respective roles.

I am grateful to my colleagues, Cuong K. NGUYEN and Ibrahima TRAORE for their
collaboration, useful advice and for making life fun while working.

I would like to express my sincere thanks to Dr. Kelay BELIHU from Debre Zeit for
proof reading some of the chapters and for his valuable comments and suggestions.

Words cannot express the contribution of the Ethiopian diaspora in and around Toulouse:
Samuel(s), Zenebech, Meraf, Silvia, Addis, Samrawit, Dejene, Efrem, Tadesse, Worku,
Genet, Azeb, Mesfin, Getu, Mengistu, Sara, just to mention a few. Let me say
“Ameseginalehu” ( ), an Amharic term to say thank you, to dear friends for
inspiring me during the last few years, for creating adventures, for supporting me when times
were rough and for making me feel at home throughout my stay.


Getachew Terefe
June 2007, Toulouse (France)

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3Table of contents page

Acknowledgement ------------------------------------------------------------------------------ 1
Dedication--------------------------------------------------------------------------------------- 3
Introduction ------------------------------------------------------------------------------------- 6
Part I. Literature review --------------------------------------------------------------------- 12
1. Haemonchus contortus ------------------------------------------------------------- 13
1.1. Morphology ---------------------------------------------------------------- 13
1.2. Life cycle ------------------------------------------------------------------- 14
1.3. Epidemiology -------------------------------------------------------------- 16
1.4. Clinical manifestations and diagnostic methods----------------------- 19
1.5. Pathophysiology of abomasal parasitism------------------------------- 20
1.6. Control of haemonchosis ------------------------------------------------- 25
2. Immune response and GI parasitism---------------------------------------------- 35
2.1. Innate immunity ----------------------------------------------------------- 35
2.2. Adaptive immunity -------------------------------------------------------- 36
2.3. Th2-polarized response during GI parasitic infections --------------- 40
2.4. Role of effector cells & antibody --------------------------------------- 43
3. Eosinophils--------------------------------------------------------------------------- 49
3.1. Biology---------------------------------------------------------------------- 49
3.2. Eosinophils in allergy ----------------------------------------------------- 57
3.3. Role of eosinophils in GI parasitism ------------------------------------ 59
Part II. Materials and methods-------------------------------------------------------------- 64
1. Experimental animals--------------------------------------------------------------- 65
1.1. The INRA 401 breed ------------------------------------------------------ 65
1.2. The Barbados Black Belly breed ---------------------------------------- 66
1.3. The Tarasconnais breed--------------------------------------------------- 66
2. The parasite and experimental infections 67
3. Methods ------------------------------------------------------------------------------ 67
3.1. Parasitological parameters------------------------------------------------ 67
3.2. Immunological parameters ----------------------------------------------- 69
43.3. Blood eosinophil isolation and in vitro tests --------------------------- 76
3.4. Intra-abomasal infection -------------------------------------------------- 80
3.5. Ultrastructural studies----------------------------------------------------- 80
3.6. Biochemical tests ---------------------------------------------------------- 81
Part III. Results ------------------------------------------------------------------------------- 84
1. Demonstration of the larval killing ability of sheep eosinophils in vitro----- 85
Publication No. 1 -------------------------------------------------- 87
2. Effect of artificially enhancing or reducing blood eosinophilic responses on
the life traits of H. contortus in sheep -------------------------------------------- 95
2.1. Enhancing host’s eosinophilic response to H. contortus by
co-infection with O. ovis.-------------------------------------------------- 95
Publication No. 2 -------------------------------------------------- 97
2.2. Suppressing the inflammatory responses in a resistant breed
(Barbados Black Belly) using sodium cromoglycate during
H. contortus infection----------------------------------------------------- 110
Publication No. 3 (in press)-------------------------------------- 111
3. Factors influencing resistance to H. contortus infection with special
reference to eosinophilia in sheep------------------------------------------------ 123
3.1. Animal breed as a factor of variation ---------------------------------- 123
Publication No. 4 (in press)-------------------------------------- 125
Publication No.5 (in preparation)------------------------------- 135
3.2. Animal age as a factor of variation------------------------------------- 154
Part IV. General discussion and perspective--------------------------------------------- 160
1. Rationale ---------------------------------------------------------------------------- 160
2. Eosinophils are capable of killing H. contortus infective larvae in vitro --- 164
3. Eosinophils during experimental infection in sheep ----------- 167
4. Conclusion and perspective ------------------------------------------------------- 173
References------------------------------------------------------------------------------------ 176
Annex. Control of H. contortus in sheep: Review (Getachew et al., 2007) -------- 213


5INTRODUCTION



Le parasitisme gastro-intestinal est une des plus sérieuses contraintes de l’élevage des
petits ruminants dans le monde. Son importance économique est due aux pertes de production
engendrées lors de fortes infestations, aux coûts de la chimioprophylaxie et parfois, à la mort
des animaux. Parmi les parasites du tube digestif des moutons, Haemonchus contortus, ver
hématophage de la caillette, est le plus important compte tenu de sa pathogénicité et de sa
grande distribution géographique (régions tropicales, subtropicales et tempérées du globe).
Le contrôle des nématodes parasites en général, et d’H. contortus en particulier, repose sur
les traitements anthelminthiques. Cependant, ces molécules ne sont pas toujours disponibles
et surtout, leur coût restreint leur utilisation dans les pays en développement. A l’inverse, lors
d’utilisation trop intensive de ces molécules, l’acquisition d’une résistance aux
anthelminthiques par de nombreuses espèces pose des problèmes de plus en plus sérieux aux
éleveurs (van Wyk et al., 1997 ; Eddi et al., 1996). Ces deux éléments soulignent
l’importance de promouvoir des stratégies de lutte alternatives au seul emploi de molécules
chimiques. En dépit d’avancées importantes réalisées jusqu’à maintenant, l’efficacité de
méthodes alternatives comme la vaccination ou la sélection d’animaux résistants est limitée
par notre méconnaissance des interactions hôtes-parasites et des mécanismes immunitaires
mis en jeu par les hôtes pour réguler les populations parasitaires.
Des études in vitro et in vivo ont montré, dans les modèles rongeurs, que les infestations
par des nématodes gastro-intestinaux entraînent une réaction immunitaire adaptative de type
Th2 (Hogan et al., 2000 ; Mckenzie et al., 1998 ; Urban et al., 1991 ; Sher et al., 1990). Les
cytokines sécrétées par les lymphocytes T CD4+ TH2 engendrent une mastocytose, une
éosinophilie sanguine et tissulaire ainsi que la production d’anticorps spécifiques (Gause et al.
2003 ; Grencis 2001 ; Else and Finkelman, 1998). Cependant, les rôles respectifs de ces
mécanismes effecteurs restent controversés (Behm and Ovington, 2000). La destruction des
parasites par les éosinophiles chez la souris est suggérée par de nombreuses études in vitro
(Shin et al., 2001 ; Strote et al., 1990 ; Butterworth, 1984 ; Kazura and Grove, 1978) ou par
des études in vivo de mobilisation sélective de ces cellules dans des chambres de diffusion
contenant des larves de parasites (Brigandi et al., 1996 ; Rotman et al., 1996). De plus, des
6-/-études in vivo utilisant des souris Il-5 ou Il-5 transgéniques suggèrent que les éosinophiles
sont impliqués dans la résistance de l’hôte même s’ils ne sont certainement pas les seuls
acteurs de cette résistance et si les résultats diffèrent selon les parasites (Klion and Nutman,
2004 ; Behm and Ovington, 2000 ; Meeusen and Balic, 2000).
Chez le mouton, les données ne sont pas aussi nombreuses que dans les modèles murins.
Toutefois, récemment, il a pu être montré que les infestations par des nématodes gastro-
intestinaux s’accompagnent de réactions immunitaires de type Th2 mettant en jeu les mêmes
mécanismes effecteurs cellulaires et humoraux (Lacroux et al., 2006 pour le modèle H.
contortus et Pernthaner et al., 2006, 2005 pour le modèle Trichostrongylus colubriformis de
l’intestin grêle). Ici aussi, les éosinophiles sont recrutés en grand nombre dans le sang et dans
les tissus infestés (Balic et al., 2006 ; Stear et al., 2002 ; Rothwell et al., 1993). Les
éosinophiles de mouton sont capables d’immobiliser des larves infestantes d’H. contortus en
présence de sérum d’animaux immuns ou de complément comme cela a été démontré in vitro
par Rainbird et al., 1998. Cependant, leur rôle protecteur in vivo est moins clair et bien moins
documenté que dans les modèles murins. Des études histologiques montrent que les
éosinophiles sont, en nombre, les principales cellules recrutées dans les muqueuses
abomasales d’animaux infestées (Balic et al., 2000) et qu’ils sont retrouvés à proximité ou en
contact de larves mortes dans les tissus (Balic et al., 2006). L’absence de moutons
-/-génétiquement modifiés (analogues des souris IL-5 ou IL-5 transgéniques) limite l’étendue
des recherches. Dès lors, la démonstration de l’implication in vivo des éosinophiles dans la
résistance aux strongles gastro-intestinaux chez le mouton repose le plus souvent sur des
corrélations entre la résistance à une infestation et l’intensité d’une réponse éosinophilique
sanguine ou tissulaire. Des variations de cette réponse sont décrites selon la race et l’âge des
animaux, la fréquence de l’exposition aux helminthes, l’espèce parasite en cause et parfois
aussi selon le protocole d’infestation expérimentale utilisé (Amarante et al. 2005 ; Stear et al.
2002 ; Thamsborg et al. , 1999 ; Woolaston et al., 1996 ; Dawkins et al., 1989). En bilan,
l’analyse de la littérature disponible chez le mouton ne permet pas de dégager une conclusion
définitive sur le rôle des éosinophiles dans la régulation des populations de strongles gastro-
intestinaux. Ceci justifie de nouvelles recherches pour comprendre le rôle exact de chaque
composante de la réponse immune. Comprendre ces mécanismes contribuera à la mise au
7point de nouveaux vaccins et/ou à la production de lignées résistantes de moutons dans un
objectif de développement de méthodes alternatives à la chimiothérapie.
Les travaux de cette thèse ont été réalisés dans le but de mieux comprendre l’implication
des éosinophiles dans la résistance du mouton à H. contortus. Compte tenu de
l’hyperéosinophilie sanguine et tissulaire constamment observée lors d’infestations naturelles
ou expérimentales, nous avons fait l’hypothèse que cette cellule joue un rôle majeur dans la
régulation des populations de ce nématode. Des études in vitro et in vivo ont été menées
afin de savoir :

i) si les éosinophiles de moutons sont effectivement capables de tuer des larves infestantes
d’H. contortus in vitro. Ceci a été confirmé après implantation chirurgicale dans la caillette de
larves ayant été en contact avec des suspensions cellulaires enrichies en éosinophiles,
ii) si l’augmentation ou la réduction préalable de la réponse éosinophilique de l’hôte a un effet
sur la résistance de celui-ci lors d’infestation expérimentale par H. contortus,
iii) quels sont les facteurs affectant la réponse éosinophilique de l’hôte lors d’infestations par
H. contortus.
Ce manuscrit est composé de quatre grandes parties : la première partie est consacrée à une
revue bibliographique sur le parasite et la réponse immunitaire de l’hôte lors d’infestation par
un nématode gastro-intestinal ; la seconde partie présente le matériel et les méthodes utilisés ;
la troisième expose les principaux résultats obtenus, enfin, la quatrième discute les résultats et
trace les principales perspectives de ce travail.
8INTRODUCTION


Gastrointestinal parasitism is arguably the most serious constraint affecting sheep
production worldwide. Economic losses are caused by decreased production, costs of
prophylaxis and treatment, and death of the infected animals. The blood-feeding nematode,
Haemonchus contortus, is among the most important gastrointestinal (GI) parasites of sheep.
This parasite, besides its pathologic significance, has a very important position from
epidemiological point of view in that it is a parasite of tropical, subtropical and temperate
regions of the world.
The control of nematode parasites in general and H. contortus in particular traditionally
relies on anthelmintic treatment. However, anthelmintics are not always available or
affordable. At the other extreme where anthelmintics are used intensively, the development of
drug resistance by many species of parasites poses a serious problem to the animal breeder
(van Wyk et al., 1997; Eddi et al., 1996) collectively demanding for other control strategies
that are less dependent on chemoprophylaxis. In spite of the enormous advances so far
registered, the development of effective alternative control strategy (vaccine, selected breeding
etc.) is hampered by limitations in properly defining and understanding of the nature of the
host-parasite interaction and the underlying immune mechanisms.
In vitro and in vivo studies in several rodent species show that Th2-polarized immune
responses characterize gastrointestinal parasitic infections (Hogan et al., 2000; Mckenzie et al.,
1998; Urban et al., 1991; Sher et al. 1990). The cytokines secreted by Th2 cells promote
mastocytosis, eosinophilia and the production of antibodies (Gause et al., 2003; Grencis, 2001;
Else and Finkelman, 1998). However, the precise roles of these effector mechanisms remain
controversial (Behm and Ovington, 2000). Eosinophil mediated killing of several helminth
species is suggested in a number of studies in mice, both in vitro (Shin et al., 2001; Strote et
al., 1990; Butterworth, 1984; Kazura and Grove, 1978) and in diffusion chambers containing
parasite larvae (Brigandi et al., 1996; Rotman et al., 1996). On the other hand, in vivo works
using IL-5 knockout or IL-5 transgenic mice suggest that eosinophils definitely involve but are
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