Analysis of infection relevant protein domains of the adeno-associated virus serotype 8 in comparison to serotype 2 [Elektronische Ressource] / Christina Raupp, geb. Stegelmann


187 Pages
Read an excerpt
Gain access to the library to view online
Learn more


INAUGURAL‐DISSERTATION  zur Erlangung der Doktorwϋrde der Naturwissenschaftlich‐Mathematischen Gesamtfakultät der Ruprecht‐Karls‐Universität Heidelberg        vorgelegt von  Christina Raupp geb. Stegelmann, MSc Biomedical Sciences  aus Jülich, Nordrhein‐Westfalen        Tag der mϋndlichen Prϋfung  18.06.2010          Analysis of Infection Relevant Protein Domains of the Adeno‐Associated Virus Serotype 8 in Comparison to  2          Gutachter:  apl. Prof. Dr. Jϋrgen Kleinschmidt Prof. Dr. Lutz Gissmann       The experimental work described in this thesis was started December 2005 and finished September 2009. C. Raupp was chosen to be a PhD student of the International PhD Program July  2005.  The  study  was  supervised  by  apl.  Prof.  Dr.  Jürgen  A.  Kleinschmidt  in  the Department Infection and Cancer of the German Cancer Research Center (DKFZ), Heidelberg.       Parts of the presented study have been published:   Characterization of a Recombinant Adeno‐Associated Virus Type 2 Reference Standard Material,  Martin  Lock,  Susan  McGorray,  Alberto  Auricchio,  Eduard  Ayuso,  E.  Jeffrey Beecham,Véronique Blouin‐Tavel, Maria Fátima Bosch‐Tubert, Mahuya Bose, Barry Byrne, TinaCaton, Jay Chiorini, Abdelwahed Chtarto, K. Reed Clark , Thomas Conlon, Christophe Darmon, Monica Doria, Anne Douar, Terry Flotte, Joyce, D. Francis, Mauro Giacca, Michael T.



Published by
Published 01 January 2010
Reads 30
Language English
Document size 8 MB
Report a problem

Erlangung der Doktorwϋrde 
Naturwissenschaftlich‐Mathematischen Gesamtfakultät 
der Ruprecht‐Karls‐Universität 
vorgelegt von 
Christina Raupp geb. Stegelmann, MSc Biomedical Sciences 
aus Jülich, Nordrhein‐Westfalen 
Tag der mϋndlichen Prϋfung 
Analysis of Infection Relevant Protein Domains of the 
Adeno‐Associated Virus Serotype 8 in Comparison to  2 
apl. Prof. Dr. Jϋrgen Kleinschmidt 
Prof. Dr. Lutz Gissmann 

The experimental work described in this thesis was started December 2005 and finished 
September 2009. C. Raupp was chosen to be a PhD student of the International PhD Program 
July  2005.  The  study  was  supervised  by  apl.  Prof.  Dr.  Jürgen  A.  Kleinschmidt  in  the 
Department Infection and Cancer of the German Cancer Research Center (DKFZ), Heidelberg. 
Parts of the presented study have been published: 
Characterization of a Recombinant Adeno‐Associated Virus Type 2 Reference Standard 
Material,  Martin  Lock,  Susan  McGorray,  Alberto  Auricchio,  Eduard  Ayuso,  E.  Jeffrey 
Beecham,Véronique Blouin‐Tavel, Maria Fátima Bosch‐Tubert, Mahuya Bose, Barry Byrne, 
TinaCaton, Jay Chiorini, Abdelwahed Chtarto, K. Reed Clark , Thomas Conlon, Christophe 
Darmon, Monica Doria, Anne Douar, Terry Flotte, Joyce, D. Francis, Mauro Giacca, Michael T. 
Korn, Irina Korytov, Xavier Leon, Barbara Leuchs, Gabrielle Kroener‐Lux, Catherine Melas, 
Hiroaki Mizukami, Philippe Moullier, Marcus Müller, Keiya Ozawa, Tina Philipsberg, Karine 
Poulard, Christina Raupp, Christel Rivière, Sigrid D. Roosendaal, R. Jude Samulski, Steven M. 
Soltys, Richard Surosky, Liliane Tenenbaum, Darby L. Thomas, Bart van Montfort, Gabor 
Veres,  J.  Fraser  Wright,  Yili  Xu,  Olga  Zelenaia,  Lorena  Zentilin  and  Richard  O  Snyder 
Stegelmann C., Poster Presentation, Analysis of infection relevant protein domains of AAV8 
ndin comparison to AAV2, Retreat in Weil der Stadt, 2008, 2  Poster Price. 
Stegelmann C., Mueller O., Kleinschmidt J. A. , ANALYSIS OF INFECTION RELEVANT PROTEIN 
Parvovirus Workshop                                   

Zusammenfassung  I 
Summary  II 
Abbreviations  III 
1. Introduction  1 
1.1 Biology of Adeno‐Associated Viruses  1 
1.1.2 Virus Classification  1 
1.1.3 AAV2 Genome  3 
1.1.4 AAV2 Proteins  6 Non‐structural Proteins  6 Structural Proteins  7 
1.1.5 AAV2 Capsid Structure 9 
1.1.6 AAV2 Capsid Assembly and Genome Encapsidation  10 
1.1.7 AAV Life Cycle  11 
1.1.8 AAV Infection  12 
1.2 AAV as a Gene Therapy Vector  15 
1.2.1 Immune Response to AAV  16 
1.2.2 AAV Vectorology  17 Improvements in Packaging Capacity and Transgene Expression  18 Natural Diversity as a Source for Transcapsidation  19 Mosaic and Chimeric Vectors  21 Ligand Conjugation and Peptide Insertion  23 DNA Family Shuffling and  Display Libraries  24 
1.3 AAV8, a New Primate AAV as a Gene Therapy Vector  27 
1.3.1. Capsid Structure and other Characteristics of AAV8 28 
1.3.2 Evaluation of AAV8 in Animal Models for Gene Therapy  30 
1.4 AAV Clinical Trials  31 
1.5 Aim of the Study  32 
2. Materials and Methods  34 
2.1 Materials  34 
2.1.1 Animals 34 
2.1.2 Cell Lines and Primary Cells  34 
2.1.3 Bacteria 35 
2.1.4 Viruses and AAV Vector Mutants  36 
2.1.5 Antibodies and Antisera  40 
2.1.6 Oligonucleotides  41 Mutagenesis Primer  41 Primer for Insertion  42 s for Semi‐Quantitative PCR  43 Primer/Probe Sets for Quantitative Real‐Time PCR  43 Oligonucleotide Library Primers  44 
2.1.7 Plasmids 44 
2.1.8 DNA Probes  47 
2.1.9 Nucleotides  47 
2.1.10 Standard Marker  48 
2.1.11 Enzymes  48 
2.1.12 Kits  48 
2.1.13 Cell Culture Media and Additives  49 
2.1.14 Constituents for Bacterial Cultures  50 
2.1.15 Chemicals  50 Special Chemicals  51 
2.1.16 Buffers and Reagents 52 
2.1.17 Equipment  53 
2.1.18 Materials  55 
2.1.19 Software  56 
2.2 Methods  57 
2.2.1 Microbiological Methods  57 Cultivation of Bacteria  57 Production of CaCl  Competent Bacteria  57 2  of Electrocompetent Bacteria  57 Transformation of CaCl  Competent Bacteria  58 2  of Electrocompetent Bacteria  58 
2.2.2 Preparation, Modification and Analysis of Plasmid DNA  59 DNA Mini‐Preparation  59 DNA Maxi‐, Mega‐ and Giga‐ Preparation  59 Precipitation and Purification of Plasmid DNA  60 DNA Isolation from Cultured Cells or Animal Tissue  60 Spectrophotometric Analysis  61 Restriction Digest of DNA  61 DNA Agarose‐Gel‐Electrophoresis  61 Preparative Agarose Gel Extraction and Purification of DNA  62 Purification of DNA Fragments after a Restriction Digest  62 Dephosphorylation of DNA Fragments  62 Ligation of DNA Fragments  63 Polymerase Chain Reaction (PCR)  63 

Index‐ PCR‐based Mutagenesis  64 TOPO Cloning  65 DNA Immobilization on a Nylon Membrane  65 Radioactive DNA Labeling  66 
2.2.3 Cell Biology Methods  67 Cultivation of Cells  67 Determination of Number of Viable Cells  67 Cell Cryo‐Conservation  67 Cultivation of Hybridoma Cells  68 Isolation of Primary Hepatocytes  68 Primary Neonatal Rat Cardiomyocyte Isolation  69 Organotypic Culture of Mouse Liver Tissue Slices  71 Transfection of Cells  73 Calcium Phosphoate (CaPO ) Transfection  73 4 PolyFect Transfection  73 
2.2.4 Virological Methods  73 Infection and Transduction of Cultured Cells  73 AAV Harvest after Transfection  74 Large‐Scale Production and Purification of AAV Particles  74 Titration of AAV Vector Stocks  75 Electron Microscopy of AAV Vector Productions (Negative Staining)  75 AAV2 Capsid ELISA  75 DNA Dot‐Blot Assay  76 Quantitative Real‐Time PCR  77 Replicative Titer Determination  77 Heparin Binding Analysis of rAAV Vectors  78 AAV Cell Binding and Entry  79 Luciferase Transgene Expression  79 AAV In Vivo Application and Analysis  80 
2.2.5 Protein Biochemical Methods  81 Bradford Method  81 
® NanoOrange  Method  81 SDS‐Page Gel Electrophoresis  81 Coomassie‐Blue Staining  82 Western‐Blot‐Transfer of Proteins  82 
2.2.6 Antibody Purification and Analysis  83 Immunological Detection after Protein Transfer  83 Antibody Purification  83 Immunofluorescences of Recombinant AAV Vectors  84 Antibody Isotyping  84 Antibody Conjugation  85 AAV8 ELISA Establishment  85 Monoclonal Antibody for AAV Vector Characterization  86 AAV Cell Binding and Entry  86 AAV N‐terminal Externalization  87 Endosomal Cleavage Analysis  87 Neutralization Analysis  88 
2.2.7 AAV8 Library Generation and Screening  88 Generation of AAV8 Library Backbone Plasmids  88 Preparation of a Random Insert Sequence  89 Ligation of Library Backbone Plasmid and Insert  90 Test Ligation  90 Large Scale Ligation  90 Production of the AAV8 Transfer Shuttle Library  92 Generation of the AAV8 Random Peptide Display Library  92 In Vitro Selection by the AAV8 Peptide Display Library  93 PCR Amplification and Sequencing of Selected Clones  93 Generation of Selected AAV8 Vector Mutants  94 
2.2.8 Statistical Data Analysis  94 
3. RESULTS  95 
3.1 In Vitro Analysis of rAAV8 in Comparison to rAAV2  95 
3.1.1 Homology between AAV8 and AAV2 Capsids 95 
3.1.2 Transduction Efficiencies of rAAV8 and rAAV2 in Different Cell Lines or Primary 
Cells  98 
3.1.3 Heparan Sulphate Proteoglycan Binding of rAAV2 and rAAV8  99 
3.1.4 Differences in Infection Pathways between AAV2 and AAV8 100 
3.1.4 Investigating Poor In Vitro Performance of AAV8  101 
3.2 In Vivo Performance of rAAV Vectors and rAAV derived Capsid Mutants  103 
3.2.1 In Vivo Analysis of rAAV2 and rAAV8  103 
3.3.2  Vector  Analysis  of  Mutants  Comprising  Large  AAV2  Domains  in  AAV8  Capsids
3.3.3 Seven Regions of Non‐conserved AA between AAV2 and AAV8  108 
3.3.4 Single AA Exchanges of Non‐Conserved Residues from AAV2 into AAV8  110 
3.3.5 Adequate Substitutions of Non‐Conserved Residues of AAV2 by those of AAV8
3.3.6 Validation of a Peptide Insertion Site within the AAV8 Scaffold  115 
3.4 Development of a Random AAV8 Peptide Display Library  117 
3.4.1 Generation and Characterization of the Plasmid Library  118 
3.4.2  Analysis  of  the  AA  Frequency  Distribution  in  the  Generated  Plasmid  Library
3.4.3 Transfer Shuttle Library Generation  120 
3.4.4 In Vitro Selection and Identification of Liver Targeting Vectors from the AAV8 
Display Peptide Library  121 Characterization of Targeting Peptides Recovered from the In Vitro Selections  123 
3.4.5 Generation of Vectors Displaying AAV8 Library Selected Peptides  125 
3.4.6 Hepatotropic Peptide Identification by Gene Transduction Analysis 126 
3.5 AAV8 dependent Cell Binding and Post‐Entry Processing  128 

3.5.1 Comparison of Genome Transfer and Transgene Expression in Different Tissues
3.5.2 Characterization of an AAV8 Capsid Specific Monoclonal Antibody ADK8  130 
3.5.3 Monoclonal Antibody ADK8 Neutralization of AAV8 Capsids 134 
3.5.4 Analysis of ADK8 Neutralization  137 
4. Discussion  143 
4.1 Comparison of rAAV8 and rAAV2 Vectors In Vitro  143 
4.2 In Vivo Analysis of Domain and Single Residue Exchanges between AAV2 and AAV8  147 
4.3 Selection of Targeted rAAV8 Vectors from the AAV8 Peptide Display Library  150 
4.4 Uncoating – A Critical Step of Post Entry‐Processing  152 
4.5 Monoclonal Antibody ADK8 Uncovers New AAV8 Capsid Features  153 
4.6 Final Conclusion  155 
5. References  156 
Acknowledgement  172 

Ausgangspunkt  für  die  in  dieser  Arbeit  durchgeführten  Untersuchungen  war  die 
außergewöhnlich  hohe  Gentransduktionseffizienz  von  AAV8  Vektoren.  Ein  Vergleich 
zwischen AAV2 und AAV8 konnte zeigen, dass sich grundlegende Unterschiede auf den 
Kapsid Oberflächen befinden, trotz einer 83 % Homologie auf der Proteinsequenzebene 
zwischen  beiden  Serotypen.  Ziel  dieser  Studie  war  es,  die  Rolle  verschiedener 
Kapsidabschnitte beim Gentransfer zu charakterisieren. In Mutanten waren entweder große 
Sequenzabschnitte zwischen AAV2 und AAV8 oder einzelne Aminosäuren von AAV2 nach 
AAV8 oder von AAV8 nach AAV2 ausgetauscht worden. Das Ersetzen von großen AAV2 
Kapsiddomänen im  AAV8 Kapsid zeigte, dass insbesondere ein Sequenzabschnitt, der in die 
Bildung der Kapsidoberfläche involviert ist, einen großen Einfluss auf die Gentransduktion 
von AAV8 hatte. Der Austausch von einzelnen Aminosäuren in dieser Region des Kapsids 
verursachte  für  AAV8,  sowie  auch  für  AAV2  Partikel,  einen  starken  Einfluss  auf  die 
Genexpression  in  vivo.  Im  Vergleich  zum  Wildtyp  AAV8  Kapsid  konnten 
Kapsidoberflächenmutanten  eine  Transduktionssteigerung,  aber  auch  eine 
Transduktionssenkung induzieren. Eine Substitution, die sich im Inneren des Kapsidmantels 
befand,   verursachte  einen  vollständigen  Verlust  der  Gentransduktion  mittels  AAV8 
Vektoren.  Hingegen  konnte  eine  weitere  Substitution,  die  an  der  inneren  Schulter  der 
"Kapsid‐Spikes" generiert worden war und Heparinbindung für das AAV8 Kapsid erzeugt 
hatte, die Transduktionseffizienz von AAV8 noch steigern. Überraschenderweise konnte eine 
reverse Substitution von AAV2 Aminosäuren durch Aminosäuren von AAV8 im Bereich der 
inneren Schulter der "Spikes" ebenfalls zu einer Steigerung der Gentransduktion von AAV2 ‐
teilweise sogar auf das Niveau von AAV8 ‐ bewirken.  
  Nach der Analyse von Domänen, die die Gentransduktion von AAV8 beeinflussen, 
wurde in das AAV8 Kapsid eine Insertionsstelle eingefügt, um zu testen, ob das Kapsid 
aufgrund  von  insertierten  Peptidsequenzen  sein  "Targetingprofil"  verändert.  Bekannte 
Peptidsequenzen, die in AAV2 Vektoren ein "Retargeting" bewirkt hatten,   konnten auch im 
AAV8 Kapsid ein verändertes "Targeting" verursachen. Eine AAV8 Bibliothek mit zufälligen 
Peptidsequenzen in dieser Insertionsstelle wurde für die Selektion von Leber‐spezifischen 
Vektoren verwendet. Es wurden Peptidmotive isoliert, die den unerwünschten Gentransfer 
von AAV8 Vektoren auf andere Organe als Lebergewebe drastisch reduzierten.  
   Studien  mit  einem  monoklonalen  Antikörper  gegen  AAV8  Kapside  zeigten,  dass 
dieser an dieselbe Stelle im AAV8 Kapsid bindet, in welche die Peptide insertiert wurden und 
welche nach Austausch gegen AAV2 Aminosäuren zu einer Transduktionssteigerung führte. 
Die Bindung der Antikörper an das Kapsid neutralisierte die Infektion, verhinderte aber nicht 
die Virusaufnahme in die Zelle. Der Mechanismus der Neutralisierung konnte jedoch nicht 
vollständig aufgeklärt werden.