Bioreactor Janssand [Elektronische Ressource] : fermentation processes in tidal-flat sediments of the German North Sea / Jutta Graue. Betreuer: Heribert Cypionka

Bioreactor Janssand [Elektronische Ressource] : fermentation processes in tidal-flat sediments of the German North Sea / Jutta Graue. Betreuer: Heribert Cypionka

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Bioreactor Janssand Fermentation processes in tidal-flat sediments of the German North Sea Von der Fakultät für Mathematik und Naturwissenschaften der Carl von Ossietzky Universität Oldenburg zur Erlangung des Grades und Titels eines Doktors der Naturwissenschaften – Dr. rer. nat. – angenommene Dissertation von Jutta Graue geboren am 30.04.1981 in Friesoythe Gutachter: Prof. Dr. Heribert Cypionka Zweitgutachter: Prof. Dr. Meinhard Simon Tag der Disputation: 28. September 2011 Table of contents Table of contents Zusammenfassung iiSummary ivList of publications viAbbreviations viii1 Introduction 11.1 High microbial activity in tidal-flat sediments 21.2 Bioreactor Janssand 21.3 Successive utilization of organic matter 31.4 Vertical distribution of electron acceptors 41.5 Experimental approach 41.6 Intact polar lipids (IPLs) as biomarker for living cells 61.7 Thesis outline 62 Publications 82.1 A laboratory experiment of intact polar lipid degradation in sandy sediments 92.2 Identifying fermenting microorganisms in anoxic tidal-flat sediments by a…..combination of microcalorimetry and ribosome-based stable-isotope probing 382.3 Degradation of cyanobacterial biomass in tidal-flat sediments:…..A combined study of metabolic processes and community changes 573 Discussion 783.1 Method development 793.

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Published 01 January 2011
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Bioreactor Janssand
Fermentation processes in tidal-flat sediments
of the German North Sea






Von der Fakultät für Mathematik und Naturwissenschaften
der Carl von Ossietzky Universität Oldenburg
zur Erlangung des Grades und Titels eines Doktors der
Naturwissenschaften
– Dr. rer. nat. –
angenommene Dissertation von





Jutta Graue
geboren am 30.04.1981 in Friesoythe










































Gutachter: Prof. Dr. Heribert Cypionka
Zweitgutachter: Prof. Dr. Meinhard Simon

Tag der Disputation: 28. September 2011
Table of contents
Table of contents
Zusammenfassung ii

Summary iv

List of publications vi

Abbreviations viii

1 Introduction 1

1.1 High microbial activity in tidal-flat sediments 2

1.2 Bioreactor Janssand 2

1.3 Successive utilization of organic matter 3

1.4 Vertical distribution of electron acceptors 4

1.5 Experimental approach 4

1.6 Intact polar lipids (IPLs) as biomarker for living cells 6

1.7 Thesis outline 6

2 Publications 8

2.1 A laboratory experiment of intact polar lipid degradation in sandy sediments 9

2.2 Identifying fermenting microorganisms in anoxic tidal-flat sediments by a

…..combination of microcalorimetry and ribosome-based stable-isotope probing 38

2.3 Degradation of cyanobacterial biomass in tidal-flat sediments:

…..A combined study of metabolic processes and community changes 57

3 Discussion 78

3.1 Method development 79

3.2 Different degradation rates of ester-bound and ether-bound IPLs 81

3.3 Degradation of monomers and polymers: a comparison 82

3.4 Outlook 83

4 References 85

Danksagung 90

i Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der anaerobe Abbau organischen Materials in Wattsedimenten umfasst mehrere Schritte.
Die terminalen Abbauschritte, Sulfatreduktion und Methanogenese, sind relativ gut
aufgeklärt, während wenig über die einleitenden Fermentationsprozesse bekannt ist. Der
Fokus dieser Studie liegt auf diesen ersten Schritten und soll folgende Fragen beantworten:
Welche Phasen des anaeroben Abbaus können identifiziert werden? Welches sind die
vorherrschenden Fermentationsprozesse und welche Organismen sind im Wesentlichen
daran beteiligt?
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neuer experimenteller Ansatz entwickelt, bei dem
Mikrokalorimetrie zur Ermittlung verschiedener Abbauschritte, chemische Analysen zur
Aufklärung der Fermentationsprozesse und „stable-isotope probing“ (SIP) zur
Identifizierung der aktiv substratassimilierenden Organismen miteinander kombiniert
wurden. Es wurden Abbauversuche mit drei verschiedenen Modellsubstraten durchgeführt.
Im ersten Teil dieser Studie wurde unmarkiertes Zellmaterial von Haloferax volcanii
und Saccharomyces cerevisiae verwendet, um die Abbauraten von archaeellen intakten
polaren Lipiden (IPLs) mit Etherbindung mit denen von bakterienähnlichen IPLs mit
Esterbindung zu vergleichen. Im Laborexperiment wurden die IPLs mit Esterbindung
schneller abgebaut als die IPLs mit Etherbindung. Neben den IPLs wurde auch organisches
Material verwertet, das aus dem Sediment stammte. Die Analyse der
Bakteriengemeinschaft mittels RT-PCR (Reverse Transkriptase PCR) basierter DGGE
(Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese) zeigte, dass sulfatreduzierende und
fermentierende Bakterien abundant waren.
13
Im zweiten und dritten Teil dieser Studie wurden C-markierte Substrate verwendet,
um die aktiv fermentierenden Bakterien mittels SIP zu identifizieren. Im zweiten Teil
wurde Glucose, im dritten Teil Biomasse von Spirulina als Substrat verwendet. Die SIP
Experimente wurden in einem abgeschlossenen System mit ausgehungertem Sediment
durchgeführt. Daraufhin wurden Reaktionsgleichungen erstellt, die die Prozesse am Ende
des Experiments beschreiben:
2- + -
58.75 Glucose + 89 SO + 17 H → 63 Acetat + 7 Propionat + 2 Butyrat + 89 HS + 4
7 CH + 180 CO + 183.5 H O 4 2 2
ii Zusammenfassung
Eine vereinfachte Biomasseformel wurde für die Biomasse von Spirulina verwendet:
2-
2530.5 <CH O> + 183 SO → 366 Acetat + 102 Propionat + 123 Butyrat + 5 Valerat 2 4
- + + 183 HS + 214 CH + 761.5 CO + 547.5 H O + 413 H4 2 2
Der Hauptverwerter der Glucose war eng mit Psychromonas macrocephali verwandt. Ein
naher Verwandter dieses Bakteriums, Psychromonas antarcticus, fermentiert Glucose zu
Acetat, Formiat, Ethanol, Lactat, CO und Butyrat. Drei Hauptverwerter der Spirulina 2
Biomasse wurden identifiziert: (i) Psychrilyobacter atlanticus, ein fermentierendes
Bakterium, das H und Acetat produziert, (ii) Bakterien, die weitläufig mit sekundären 2
Gärern der Gattung Propionigenium verwandt sind und (iii) ein entfernter Verwandter von
Cytophaga.
iii Summary
Summary
The anaerobic organic matter degradation in tidal-flat sediments is a multi-phase process.
The terminal degradation steps, methanogenesis and sulfate reduction, are well studied.
The initial fermentation processes, however, are poorly understood. The present study
focused on these first steps and aimed at answering the following questions: Which phases
of anaerobic degradation can be distinguished? What are the predominant fermentation
processes? Which are the involved key players?
A new experimental approach was developed which combines microcalorimetry to
detect different degradation phases, chemical analyses to identify the fermentation
processes and stable-isotope probing (SIP) to determine the actively substrate assimilating
organisms. Degradation experiments with three different model substrates were conducted.
In the first part of this study, unlabeled cell material of Haloferax volcanii and
Saccaromyces cerevisiae was used to compare the degradation rates of ether-bound
archaeal and ester-bound bacteria-like intact polar lipids (IPLs). IPLs are commonly used
as biomarkers for viable cells. In the laboratory experiment ester-bound IPLs were
degraded faster than ether-bound IPLs. The degradation of the IPLs was accompanied by
the degradation of organic matter originating from the sediment. The community analysis
via RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) based DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis) showed a high abundance of sulfate-reducing and fermenting bacteria.
13
For the second and third part of this study, C-labeled substrates were used to identify
the actively fermenting bacteria via SIP. The substrate used for the second part was
glucose, whereas Spirulina-biomass was used for the third part. The SIP experiments were
conducted in closed systems with starved sediment. Reaction equations were established to
summarize the processes at the end of the experiments:
2- + -
58.75 glucose + 89 SO + 17 H → 63 acetate + 7 propionate + 2 butyrate + 89 HS + 4
7 CH + 180 CO + 183.5 H O 4 2 2
iv Summary
A simplified biomass formula was used for Spirulina-biomass:
2-
2530.5 <CH O> + 183 SO → 366 acetate + 102 propionate + 123 butyrate + 2 4
- + 5 valerate + 183 HS + 214 CH + 761.5 CO + 547.5 H O + 413 H4 2 2
The main glucose assimilating organism was closely related to Psychromonas
macrocephali. Another close relative, Psychromonas antarcticus ferments glucose to
acetate, formate, ethanol, lactate, CO and butyrate. Three main degraders of Spirulina­2
biomass were identified as: (i) Psychrilyobacter atlanticus, a fermenter known to produce
H and acetate, (ii) bacteria distantly related to secondary fermenting bacteria of the genus 2
Propionigenium and (iii) a remote Cytophaga-related bacterium.
v Publications
List of publications
The results published in this dissertation have been submitted to international journals:
1. J. Logemann, J. Graue, J. Köster, B. Engelen, J. Rullkötter, and H. Cypionka,
A laboratory experiment of intact polar lipid degradation in sandy sediments (2011),
submitted to Biogeosciences Discuss., 8, 3289-3321
Concept: J. L., J. G., J. K., B. E., J. K., H. C. ; IPL and fatty acid analyses: J. L.;
Molecular biological analyses: J. G.; Fermentation products, methane and sulfate
analyses: J. G.; First draft of manuscript: J. L., J. G.; Revision: H. C., B. E., J. K. J. R.
2. J. Graue, Sara Kleindienst, Tillmann Lueders, Heribert Cypionka, Bert Engelen,
Identifying fermenting microorganisms in anoxic tidal-flat sediments by a combination
of microcalorimetry and ribosome-based stable-isotope probing (2011), submitted to
Applied and Environmental Microbiology
Concept: B. E., S. K., J. G., T. L., H. C.; Electron micrographs: S. K.; Comparison of
nucleic acid extractions: S. K.; Molecular biological analyses: J. G.; Chemical
analyses: J. G; First draft of manuscript: S. K; J. G., B. E., Revision: B. E., H. C., T. L.
3. J. Graue, B. Engelen and H. Cypionka, Degradation of cyanobacterial biomass in
tidal-flat sediments: A combined study of metabolic processes and community changes
(2011), submitted to ISME Journal
Concept: J. G., H. C.; Molecular biological analyses: J. G.; Chemical analyses: J. G.;
First draft of manuscript: J. G.; Revision: H. C., B. E.;
vi Further publications
Further publications
M. Beck, T. Riedel, J. Graue, J. Köster, N. Kowalski, C. S. Wu, G. Wegener,
Y. Lipsewers, H. Freund, M. E. Böttcher, H.-J. Brumsack, H. Cypionka, J. Rullkötter, and
B. Engelen (2011) Imprint of past and present environmental conditions on microbiology
and biogeochemistry of coastal Quaternary sediments. Biogeosciences, 8, 55-68
M. Seidel, J. Graue, B. Engelen , J. Köster, H. Sass and J. Rullkötter, Intact polar ,
membrane lipids in tidal flat sediments indicate active microbial communities impacted by
advective pore water transport, submitted to Geochimica et Cosmochimica Acta
vii Abbreviations
Abbreviations

BES 2-Bromoethanesulfonic acid
BLAST Basic Logical Alignment Search Tool
BSA Bovine Serum Albumin
bp Base pair
C Carbon
°C Degree Celsius
d Day
Delta
DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
DNA Deoxyribonucleic Acid
dNTP Deoxyribonucleoside Triphosphate
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
(German Resource Center for Biological Material)
dsr Dissimilatory sulfite reductase
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
e. g. Exempli gratia (for example)
EMBL European Molecular Biology Laboratory
et al. Et alii (and others)
f forward
Fig. Figure
FISH Fluorescence In Situ Hybridization
g Gram
g Gravitational acceleration
G Gibbs free energy
G Gibbs free energy under standard conditions 0
G ` Gibbs free energy under standard conditions at pH 7 0
GC Gas Chromatograph
h Hour
HPLC High Performance Liquid Chromatography
IPL Intact Polar Lipid
J Joule
viii