Chemoenzymatic synthesis of chromodepsipeptides and natural product discovery via genome mining [Elektronische Ressource] = Chemoenzymatische Synthese der Chromodepsipeptide und Isolierung neuer Naturstoffe durch genomisches Mining / vorgelegt von Lars Robbel

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Chemoenzymatic Synthesis of Chromodepsipeptides and Natural Product Discovery via Genome Mining Chemoenzymatische Synthese der Chromodepsipeptide und Isolierung neuer Naturstoffe durch Genomisches Mining Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) dem Fachbereich Chemie der Philipps‐Universität Marburg vorgelegt von Lars Robbel aus Mainz Marburg an der Lahn, 2010 Vom Fachbereich Chemie der Philipps‐Universität Marburg als Dissertation am 30.06.2010 angenommen. Erstgutachter : Prof. Dr. M. A. Marahiel (Philipps‐Universität Marburg) Zweitgutachter : Prof. Dr. L.‐O. Essen (Philipps‐Universität Marburg) Tag der Disputation: 14.07. 2010 Dedicated to my paren…t s Abstract Abstract Recent advances in the development of sequencing thencologies have enabled the identification of ai tmudlet of bacterial gene clusters, putatively involved inb itohesy nthesis of nonribosomal peptides (NRPs). Pdeepst iof nonribosomal origin constitute a class of structlulrya and functionally diverse natural products, hw ahirec assembled by multimodular nonribosomal peptide synhtetases (NRPSs).

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Published 01 January 2010
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Chemoenzymatic Synthesis of Chromodepsipeptides and Natural Product Discovery via
Genome Mining

Chemoenzymatische Synthese der Chromodepsipeptide und Isolierung neuer Naturstoffe
durch Genomisches Mining


Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)

dem
Fachbereich Chemie
der Philipps‐Universität Marburg
vorgelegt von




Lars Robbel
aus Mainz





Marburg an der Lahn, 2010




























Vom Fachbereich Chemie
der Philipps‐Universität Marburg als Dissertation
am 30.06.2010 angenommen.

Erstgutachter : Prof. Dr. M. A. Marahiel
(Philipps‐Universität Marburg)

Zweitgutachter : Prof. Dr. L.‐O. Essen
(Philipps‐Universität Marburg)

Tag der Disputation: 14.07. 2010




































Dedicated to my paren…t s




























































Abstract
Abstract

Recent advances in the development of sequencing thencologies have enabled the identification of ai tmudlet of
bacterial gene clusters, putatively involved inb itohesy nthesis of nonribosomal peptides (NRPs). Pdeepst iof
nonribosomal origin constitute a class of structlulrya and functionally diverse natural products, hw ahirec
assembled by multimodular nonribosomal peptide synhtetases (NRPSs). These compounds exhibit a broad
pharmacological spectrum, ranging from antibacterialto‐ immunosuppressive properties. Understanding the
assembly mechanisms in combination with rational geonme mining approaches will provide opportunities fthoer
discovery of new bioactive natural products.
Within this study one approach was utilized to ge antee rthiocoraline analogs via chemoenzymatic synthiess and the
second strategy focused on the de novo natural product discovery via genome mining.
Thiocoraline represents a pseudosymmetrical chromophore‐capped octathiodepsipeptide, in which the
symmetrical halves are linked via thioester bondIsn. this study, the cyclodimerization potentialh eo ft htioesterase
domain of the thiocoraline biosynthetic machinerTyi o(S PCP‐TE) was investigated to obtain furthergh itnss iinto the
iterative assembly of chromodepsipeptides. To addsrse this objective, the recombinant enzyme was incautbed with
synthetically derived tetrapeptidyl substrates,e mrbelsing thiocoraline precursors. It was shown ththaet enzyme
catalyzes the cyclodimerization of linear precur smoorlecules and an unprecedented macrothiolactonizaiton.
Evaluation of the biocombinatorial potential eissthaebdl the thioesterase as a robust and versatileta clayst for the
generation of chromodepsipeptide analogs, harbouring hiotester‐ or ester‐linkages. As thiocoraline att aiitns s
antitumor activity from DNA‐bisintercalation, theh ecmoenzymatically generated macrocycles were isolaetd and
investigated towards DNA‐bisintercalation activint y vitro.
In the second part of this study, bioinformatic laysnias of the 8.2 MbS accharopolyspora erythraea genome
revealed two cryptic NRPS gene clusters related toy dhroxamate‐type siderophore biosynthesis. Detailaenda lysis of
adenylation domain substrate‐specificity and modu olerganization enabled the establishment of a high ellye cstive
and sensitive radio‐LCMS‐guided genome mining apprcoha. Application of this approach resulted in thseco dviery
n
of the siderophore erythrochelin. Structure eluctidoan of erythrochelin was accomplished via NMR‐ an dMS ‐
analysis and revealed the sequence of the tetrapiedpet siderophore to be: ‐N ‐acetyl‐ ‐N‐acetyl‐ ‐N-hydroxy‐D‐
ornithineD‐‐serine‐cyclo(‐N-hydroxy‐L‐ornithine‐‐N‐acetyl‐ ‐N-hydroxy‐L‐ornithine).
Erythrochelin assembly requires the proliferatiofn ‐oN-hydroxy‐L‐ornithine L(‐hOrn) and ‐N‐acetyl‐ ‐N-hydroxy‐
L‐ornithine L(‐haOrn). The corresponding modifying enzymes, the FA‐Ddependent monooxygenases EtcB and
Sace_1309 together with the bifunctional malonyl‐C odAecarboxylase/N‐acetyltransferase were identified and
biochemically characterized.In vitro studies revealed EtcB and Sace_1309 to exclusiv eclaytalyze the ‐N‐
hydroxylation of freeL‐ ornithine. The second tailoring enzyme, Mcd, was oswhn to catalyze malonyl‐CoA
decarboxylation and subsequent acetyltransfer ontoth e ‐hydroxamino group of L‐hOrn, affording
L‐haOrn. Based on the elucidation of precursor binotshyesis (L‐haOrn), a model for the entire erythrochelin
assembly is presented.
V
adddddddddd Zusammenfassung
Zusammenfassung

Die Entwicklung neuartiger Sequenzierungstechnologienr möglicht die Identifizierung einer Vielzahl von
kryptischen bakteriellen Genclustern, welche an dBeirosynthese nichtribosomaler Peptide (NRPs) betiegti lsind.
Peptide nichtribosomalen Ursprungs konstituieren eien Klasse strukturell diverser Naturstoffe, welcheu rcdh
multimodulare Peptidsynthetasen (NRPSs) assemblie rtwerden. Nichtribosomale Peptide weisen ein bre ites
pharmakologisches Spektrum als Antitumor‐Wirkstoffe, Antibiotika oder Immunosuppressiva auf. Das einegendhe
Verständnis der nichtribosomalen Assemblierungsmecha nismen, in Kombination mit rationalem genomischen
Mining ermöglicht die Identifizierung neuartiger, tbiivoear kVerbindungen.
Die vorliegende Arbeit umfasst neben der chemoenzymatischen Synthese von Thiocoralin‐Analoga didee novo
Identifizierung neuer Naturstoffe durch genomischesi nM ing.
Thiocoralin stellt ein makrozyklisches Oktathiodeippseptid dar, in welchem die mit exozyklischen Chroopmhoren
funktionalisierten Oligopeptide über zwei Thioestienrdbungen verbunden sind. In dieser Arbeit wurde das
Zyklodimerisierungspotential der Thiocoralin Thiteoreasse‐Domäne (TioS PCP‐TE) untersucht, um ein genaeures
Verständnis der iterativen Assemblierung der Chiinno‐l und Chinoxalinchromodepsipeptide zu erhalteni.e rHzu
wurde das Enzym rekombinant produziert und mit synthetischen, linearen Peptidylsubstratanaloga inkut.b iTeiroS
PCP‐TE katalysierte die Zyklodimerisierung der alriene Tetrapeptidylsubstrate unter Ausbildung versichedener
Makrothiolaktone. Die Evaluierung des biokombinatsochrien Potentials ergab eine relaxierte Substratsfpietzäit des
Enzyms und ermöglichte die Generierung von Chromodepsipeptid‐Analoga. Die chemoenzymatisch generierten
makrozyklischen Laktone oder Thiolaktone wurden isloiert und auf ihre DNA‐Bisinterkalationsaktivitiänt h
untersucht.
Im zweiten Teil dieser Arbeit resultierte die fboiormiantische Analyse des 8.2 Mb umfassenden Genoms v on
Saccharopolyspora erythraea in der Identifizierung von zwei kryptischen Hydmraotx‐Saiderophor NRPS
Genclustern. Die Analyse der Adenylierungs‐Domänen Substratspezifität und der modularen Organisation
ermöglichte die Etablierung eines hochselektiven uhnodch sensitiven Radio‐LCMS‐geleiteten genomischen Minnig
Ansatzes. Die Anwendung dieses Ansatzes resultiertien der Entdeckung des Siderophors Erythrochelin. Die
strukturelle Charakterisierung von Erythrochelin dweu r mittels NMR‐spektroskopischen sowie
massenspektrometrischen Studien realisiert und erga fbür die Sequenz des Tetrapeptid‐Siderophors‐:N ‐ Acetyl‐ ‐
N‐acetyl‐ ‐N-hydroxy‐D‐Ornithin‐D‐Serin‐zyklo(‐N-Hydroxy‐ L‐Ornithin‐ ‐N‐Acetyl‐ ‐N-hydroxy‐L‐Ornithin).
Die Assemblierung von Erythrochelin erfordert die nSthyese von ‐N-Hydroxy‐L‐Ornithin (L‐hOrn) und
‐N‐Acetyl‐ ‐N-hydroxy‐L‐Ornithin (L‐haOrn). Zur Untersuchung der korrespondierenden Bisoynthesen wurden die
FAD‐abhängigen Monooxygenasen EtcB und Sace_1309, sowei die bifunktionelle Malonyl‐CoA DecarboxylaNs‐e/
Acetyltransferase Mcd, identifiziert und biochemihs charakterisiert. Mittelisn vitro‐Studien wurde gezeigt, dass
EtcB und Sace_1309 ausschließlich die‐ N-Hydroxylierung von freiemL ‐Ornithin katalysieren. Mcd katalysierte die
Decarboxylierung von Malonyl‐CoA und einen anschlienßden Acetyltransfer auf die‐ Hydroxamino Funktionalität
von L‐hOrn unter Bildung von L‐haOrn. Die Aufklärung der Biosynthese des Vorläufmoerleküls L‐haOrn resultierte in
der Postulierung eines umfassenden Modells für dises eAmblierung von Erythrochelin.
VI
dddddaddddd Publications
The majority of the work presented herein has bpeuebnli shed:

Robbel, L., Hoyer, K.M., Marahiel, M.A., (2009), TioS Ta‐ TEp ro‐ totypical thioesterase responsible for
the cyclodimerization of the quinoline‐ and quinlionxea‐type class of chromodepsipeptides, FEBS J., 276,
1641‐1653.

Robbel, L., Knappe, T.A., Linne, U., Xie, X., Marahi,e l(,2 0M.1A0.), Erythrochelin ‐ a hydroxamate‐type
siderophore predicted from the genome of Saccharopolyspora erythraea,F EBS J., 277, 663‐676.

Additional publications:

Knappe, T.A., Linne, UR.o,b bel, L., Marahiel, M.A., (2009), Insights into the bieossyis natnhd stability of
the lasso peptide capistruiCnh,e m. Bio,l. 16, 1290‐1298.

Robbel, L., Marahiel, M.A., (2010), Daptomycin, a bactleirpioaple ptide synthesized by a nonribosomal
machinery, J. Biol. Ch.e,m in press, doi: 10.1074/jbc.R110.128181.























VII Abbreviations
Abbreviations

3HQA 3‐hydroxy‐quinaldic acid
A‐domain adenylation domain
aa amino acid
ACE angiotensin converting enzyme
ac‐haOrn ‐N‐acetly‐ ‐N‐acetyl‐ ‐N‐hydroxy‐L‐ornithine
ACP acyl carrier protein
ACT Artemis Comparison Tool
‐KG ‐ketoglutarate
AMP adenosine monophosphate
AT acetyltransferase
ATP adenosine‐5'‐triphosphate
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
Boc tert‐butoxycarbonyl
bp base pairs
C‐domain condensation domain
Cy‐domain heterocyclization domain
CAS chromazurol S
CDA calcium‐dependent antibiotic
CDS coding sequence
CoA coenzyme A
COSY correlation spectroscopy
DA dalton
DCM dichloromethane
DHB 2,3‐dihydroxybenzoic acid
DIPEA N,N‐diisopropylethylamine
DKP diketopiperazine
DMF dimethyl formamide
DMSO dimethylsulfoxide
DNA deoxyribonucleic acid
DQF double quantum filtering
E‐domain epimerization domain
EDA ethylenediamine
EDC N‐(3‐dimethylaminopropyl)N‐'‐ethylene carbodiimide hydrochloride
EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
EIC extracted ion chromatogram
ESI electron‐spray ionization
F‐domain N‐formylation domain
Fl‐CoA fluoresceinyl‐CoA
FT‐ICR fourier transform ion cyclotron resonance
FP‐TAMRA fluorophosphonate‐ N,N,N´,N´-tetramethylrhodamine
FA fatty acid
FAD flavin adenine dinucleotide
FDAA [N‐ ‐(2,4‐dinitro‐5‐fluorophenLy‐la)l‐aninamide]
FMOC fluorenylmethyloxycarbonyl
FPLC fast protein liquid chromatography
haOrn ‐N‐acetyl‐ ‐N‐hydroxy‐L‐ornithine
VIII
dddaaaad Abbreviations
HBTU O‐BenzotriazoleN‐,N,N’,N’‐tetramethyl‐uronium‐hexafluoro‐phosphate
HEPES 4‐(2‐hydroxyethyl)‐1‐piperazine ethanesunilcf oacid
HHL N‐hippurylL‐‐histidylL‐leucine
Hip hippuric acid
HL L‐histidylL‐leucine
HMBC heteronuclear multiple bond coherence
HOAt 1‐hydroxy‐7‐azabenzotriazol
HOBt hydroxybenzotriazole
hOrn ‐N-hydroxy‐L‐ornithine
HPLC high performance liquid chromatography
HRMS high resolution mass spectrometry
HSQC heteronuclear single‐quantum correlation spteroc scopy
IPTG isopropyl‐‐D‐thiogalactopyranoside
kbp kilo base pairs
kDa kilo Dalton
lac lactose
MT‐domain methyltransferase domain
mbp mega base pairs
MDa mega Dalton
MeCN acetonitrile
MIC minimum inhibitory concentration
MOPS 3‐( N‐morpholino)propanesulfonic acid
mRNA messenger ribonucleic acid
MRSA methicillin‐resistant Staphylococcus aureus
MS mass spectrometry
NDP nucleoside diphosphate
NIS NRPS independent siderophore
NOE nuclear Overhauser effect
NRP nonribosomal peptide
NRPS nonribosomal peptide synthetase
NTA nitrilotriacetic acid
Ox‐domain oxidation domain
OD optical density
ORF open reading frame
PCP peptidyl‐carrier‐protein
PCR polymerase chain reaction
PDB protein data bank
PK polyketide
PKS polyketide synthase
ppan 4’‐phosphopantetheine
PPAT phosphopantetheine adenosine transferase
PPi inorganic pyrophosphate
PPTase 4’‐phosphopantetheine transferase
PyBop benzotriazol‐1‐yl‐oxytripyrrolidinophospihuomn hexafluorophosphate
QA quinaldic acid
QTOF quadrupole time‐of‐flight
QX quinoxaline‐2‐carboxylic acid
R‐domain reductase domain
IX
bd Abbreviations
RNA ribonucleic acid
RP reversed‐phase
RT room temperature
SAM S‐adenosylmethionine
SDS sodium dodecyl sulfate
SDS‐PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide geelle ctrophoresis
SIC selected ion chromatogram
SNAC N‐acetylcysteamine
sp. species
str. strain
TCEP tris‐(carboxyethyl)‐phosphine
TE thioesterase domain
TEII type II thioesterase
TES triethyl silane
TFA trifluoroacetic acid
TFE trifluoroethanol
TIC total ion chromatogram
TIPS triisopropylsilane
TOCSY total correlation spectroscopy
t retention time in minutes R
TRIS tris‐(hydroxymethyl)‐aminomethane
Trt trityl
tRNA transfer ribonucleic acid
VRE vancomycin‐resistant Enterococci
w/o withou t

Table 1:Ov erview of the proteinogenic amino acid Tsh.e three‐ and one‐letter codes are given for each amino
acid as well as the molecular weig ht .

amino acid three letter code one letter code aM)W (D

alanine Ala A 89
arginine Arg R 174
asparagine Asn N 132
aspartic acid Asp D 133
cysteine Cys C 121
glutamic acid Glu E 147
glutamine Gln Q 146
glycine Gly G 75
histidine His H 155
isoleucine Ile I 131
leucine Leu L 131
lysine Lys K 146
methionine Met M 149
phenylalanine Phe F 165
proline Pro P 115
serine Ser S 105
threonine Thr T 119
tryptophan Trp W 204
tyrosine Tyr Y 181
valine Val V 117
X