Growth zone instability in T-shaped Schizosaccharomyces pombe cells [Elektronische Ressource] / presented by Ioannis Legouras

English
115 Pages
Read an excerpt
Gain access to the library to view online
Learn more

Description

Dissertationsubmitted to theCombined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematicsof the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germanyfor the degree ofDoctor of Natural Sciencespresented byDiplom-Biologe Ioannis Legourasborn in: Patra, GreeceOral-examination: ..............................Growth zone instability in T-shapedSchizosaccharomyces pombe cellsSupervisor:Dr. Fran cois NedelecReferees:Dr. Damian BrunnerDr. Jochen WittbrodtContents1 Introduction 51.1 Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51.2 The Cytoskeleton . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61.3 An introduction to Schizosaccharomyces pombe . . . . . . . . . . . . . . . 71.3.1 History and General information . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71.3.2 Establishment of polarity in S.pombe . . . . . . . . . . . . . . . . . 71.4 Microtubule-dependent growth in S.pombe . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91.4.1 MT plus-end tips . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101.4.2 Polarity machinery . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131.4.3 Ectopic Growth Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261.5 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281.6 Methods for shape change . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291.7 Aim of Thesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Subjects

Informations

Published by
Published 01 January 2010
Reads 10
Language English
Document size 6 MB
Report a problem

Dissertation
submitted to the
Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics
of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany
for the degree of
Doctor of Natural Sciences
presented by
Diplom-Biologe Ioannis Legouras
born in: Patra, Greece
Oral-examination: ..............................Growth zone instability in T-shaped
Schizosaccharomyces pombe cells
Supervisor:
Dr. Fran cois Nedelec
Referees:
Dr. Damian Brunner
Dr. Jochen WittbrodtContents
1 Introduction 5
1.1 Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2 The Cytoskeleton . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.3 An introduction to Schizosaccharomyces pombe . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3.1 History and General information . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3.2 Establishment of polarity in S.pombe . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.4 Microtubule-dependent growth in S.pombe . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.4.1 MT plus-end tips . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.4.2 Polarity machinery . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.4.3 Ectopic Growth Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
1.5 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
1.6 Methods for shape change . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
1.7 Aim of Thesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2 Results 31
2.1 Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.1.1 Terminology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.2 Wild Type cells (WT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.2.1 Polarity in the presence or absence of MTs . . . . . . . . . . . . . 32
2.2.2 Polarity of T-shaped cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.2.3 Geometry - Growth - Nucleus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.2.4 Ge vs Growth . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.2.5 MTs vs Growth . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.2.6 Geometry vs MTs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.2.7 Growth Maintenance - Growth Switch . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.2.8 Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
2.3 Tea1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.3.1 Polarity of T-shaped cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.3.2 Geometry - Growth - Nucleus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.3.3 Ge vs Growth . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.3.4 MTs vs Growth . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.3.5 Geometry vs MTs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.3.6 Growth Maintenance - Growth Switch . . . . . . . . . . . . . . . . 53
32.3.7 Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.4 Tea4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.4.1 Polarity of T-shaped cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.4.2 Geometry - Growth - Nucleus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.4.3 Ge vs Growth . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.4.4 MTs vs Growth . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
2.4.5 Geometry vs MTs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
2.4.6 Growth Maintenance - Growth Switch . . . . . . . . . . . . . . . . 60
2.4.7 Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
2.5 Mod5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
2.5.1 Polarity of T-shaped cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
2.5.2 Geometry - Growth - Nucleus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
2.5.3 Ge vs Growth . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
2.5.4 MTs vs Growth . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
2.5.5 Geometry vs MTs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
2.5.6 Growth Maintenance - Growth Switch . . . . . . . . . . . . . . . . 69
2.5.7 Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
2.6 Bud6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.6.1 Polarity of T-shaped cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.6.2 Geometry - Growth - Nucleus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
2.6.3 Ge vs Growth . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
2.6.4 MTs vs Growth . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
2.6.5 Geometry vs MTs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
2.6.6 Growth Maintenance - Growth Switch . . . . . . . . . . . . . . . . 79
2.6.7 Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
3 Discussion 81
3.1 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
3.2 Nuclear localization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
3.3 Growth dependencies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
3.4 Growth switch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
4 Methods 87
4.1 Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
4.2 Cell Growing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
4.3 Branching protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
4.3.1 Heterogeneity of branching e ciency . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
4.4 Strain preparations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
4.5 Microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
4.5.1 Sample preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
4.5.2 Confocal Spinning Disk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
4.5.3 Movie acquisition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
4.6 Image processing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
4.6.1 Cell Outlines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 884.6.2 Cell Center - Cell Ends . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.6.3 Nucleus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.6.4 Microtubules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.7 Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.7.1 Box plots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.7.2 Scatterplots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
Bibliography 91
Acknowledgements 103
A List of strains 105
B Quanti cations 107
C Summarizing graphs 109Abstract
Morphogenesis is a complex process which in unicellular organisms involves mainly
polarized cell growth and cell division. Microtubules (MTs) are a key player in spatial
regulation of cytokinesis and polarization. The ssion yeast Schizosaccharomyces pombe
is a convenient model organism for morphogenesis studies because of its simple cylindrical
shape and its polarized growth at the cell tips. MT plus ends contact and shrink from
the cell tips and contribute to polarity regulation. There is a strong crosstalk between
MTs, actin and cell shape.
Here we perturb the cell shape and we investigate the e ects on MTs, nuclear position
and polarization machinery. We use the MT-depolymerizing drug thiabendazole (TBZ)
to depolymerize the interphase microtubules. MT depolymerization causes formation
of arms around the middle of the cell perpendicular to the long axis of the cell. The
organization of the MT cytoskeleton exhibits heterogeneity in these T-shaped cells and
depends on the cell geometry. We found that growth zones that were formed in the
absence of microtubules, have di erent properties compared to the old ends of the cell
and they exhibit an inherent instability, as measured by their growth potential. This
growth potential in the arm is proportional to the initial size and to the number of MTs
that reach the arm cortex. These e ects are Tea1p-Tea4p-Mod5p dependent but Bud6p
independent.
These studies provide a demonstration of how MTs in uence the growth potential
at cell ends in ssion yeast and begin to suggest a new model of growth zone instability.
MT interactions with the cortex are important not only for establishment but also for
maintenance of growth zones. These ndings highlight a previously hidden role of MTs
responsible for cell morphogenesis.2
Zusammenfassung
Morphogenese ist ein komplexer Prozess. In einzelligen Organismen basiert er haupts ach-
lich auf polarisiertem Zellwachstum und Zellteilung. Mikrotubuli (MTs) sind Schlussel-
faktoren in der aumlicr hen Regulierung von Zytokinese und Polarisierung. Die Spalthefe
Schizosaccharomyces pombe ist ein guter Modellorganismus fur die Studie der Morpho-
genese, aufgrund seiner einfachen zylindrischen Form und polarisiertem Zellwachstum an
den Zellspitzen. MT Plus-Enden beruhren die Zellspitzen, depolymerisieren dann und
spielen somit eine wichtige Rolle in der Regulierung von Polarit at. Ein enges Zusam-
menspiel zwischen MTs, Aktin und Zellform ist zu beobachten.
In dieser Arbeit fuhren wir St orungen in der Zellform herbei und untersuchen deren
Auswirkungen auf MTs, die Polarisierungsmaschinerie und die Position des Zellkerns.
Wir verwenden die Substanz Thiabendazole (TBZ) um Mikrotubuli in der Interphase
zu depolymerisieren. Die Depolymerisierung von MTs fuhrt zur Bildung von Asten
in der Zellmitte, die senkrecht zur Zellachse verlaufen. Die Organisation der MTs in
diesen Zellen, die die Form eines Ts annehmen, ist heterogen und abh angig von der
Zellgeometrie. Wir haben beobachtet, dass Wachstumszonen, die in der Abwesenheit von
Mikrotubuli gebildet werden, andere Eigenschaften aufweisen als solche an den normalen
Zellenden. Messungen des Wachstumspotentials zeigen eine inherente Instabilit at. Das
Wachstumspotential in den Armen ist proportional zu der Ausgangsgr o e und der Zahl
von MTs die den Cortex des Armes erreichen. Diese E ekte sind abh angig von Tea1p-
Tea4p-Mod5p, aber unabh angig von Bud6p.
Die Studie zeigt den Ein uss von MTs auf das Wachstumspotential an Zellenden der
Spalthefe und deutet auf ein neues Modell fur die Instabilit at von Wachstumszonen hin.
Die Interaktion zwischen MTs und Kortex spielt eine wichtige Rolle in der Anlage und
dem Erhalt von Wachstumszonen. Unsere Ergebnisse weisen auf eine bisher unbekannte
Rolle von MTs in der Zellmorphogenese hin.3
Abbreviations and Terminology
MT Microtubule
iMTOC Interphase Microtubule organizing center
Lat A Latrunculin A
MBC Methyl-2-benzimidazole-carbamate
TBZ Thiabendazole
ts Temperature sensitive
EMM2 Edinburgh Minimal Media 2
+TIP plus end interacting protein4Chapter 1
Introduction
Figure 1.1: A DIC-picture of ssion yeast.
1.1 Overview
Eukaryotic cells display a wide range of polarized morphologies. They devise various
ways to establish morphogenesis, the core mechanisms of which are evolutionarily con-
served (Nelson, 2003; Siegrist and Doe, 2007). External cues such as mating pheromones
in budding and ssion yeasts or sperm entry in Caenorhabditis elegans can direct cell
polarity (Chant, 1999; Goldstein and Hird, 1996; Nielsen and Davey, 1995; Segall, 1993).
The polarity of the single cell zygote also determines the organism’s body plan in organ-
isms such asDrosophila melanogaster,Caenorhabditis elegans andXenopus laevis (Ruiz i
Altaba and Melton, 1990; Bowerman and Shelton, 1999; Lall and Patel, 2001). Polarized
shape is generally de ned by organized dynamic interactions between the cytoskeletal
laments, with actin located at the sites of growth and microtubules directing the over-
all cell shape. Neuronal axons have stable, parallel and polarized arrays of microtubule
bundles (Laferriere et al., 1997) and dynamic broblasts have dynamic microtubules
(Liao et al., 1995). Cell shape is also important in carcinogenesis, and there are indica-
tions that cancer cells can be made to form morphologically normal structures and are
more resistant to apoptosis when grown in certain three-dimensional contexts that force
speci c shapes on them (Wang et al., 2002; Weaver et al., 2002).
From simple molecular assemblies to cells, organs, and organisms, the generation of
form is a central issue in biology. At the molecular level, assemblies are governed by
short-range interactions. At the cellular level, however, distinct mechanisms must exist
5