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Identification du facteur catalytique du processus d’édition des ARN des organites chez les plantes, Identification of the RNA editing enzyme in plant organelles

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Description

Sous la direction de Claire Lurin, Ian Small
Thèse soutenue le 18 juillet 2008: Evry-Val d'Essonne, UWA Australie
Chez les plantes, l’édition des ARN dans les organites conduit principalement à des conversions de cytidines en uraciles. Des protéines de la famille PPR (pentatricopeptide repeat) sont impliquées dans ce processus. Mon travail a permis de montrer que le domaine DYW présent chez certaines protéines PPR présente des homologies avec le site catalytique de cytidines désaminases et que sa distribution phylogénétique corrèle avec celle de l’édition dans la lignée verte. Par ailleurs, chez A. thaliana, l’analyse de mutants affectés dans l’expression du gène AtDYW1, codant une protéine uniquement constituée du domaine DYW et d’un peptide signal pour les organites, a révélé l’existence de plantules au développement très affecté et pour lesquelles plusieurs défauts d’édition dans des ARNm chloroplastiques ont pu être caractérisés. Pris ensemble, ces éléments suggèrent que le domaine DYW ou la protéine AtDYW1 pourraient être l’enzyme centrale catalysant les réactions d’édition.
-Domaine DYW
RNA editing in plants organelle transcripts is a proccess leading to specific post-transcriptional pyrimidine interconversions (mainly C-to-U). Recently a few pentratricopeptide repeat (PPR) proteins were described to be essential in this process. During my PhD, I found that the DYW domain of PPR proteins show similarities with the active site of cytidine deaminases, and that the phylogenetic distribution of this domain is strictly correlated with RNA editing in green plants. In addition, in A. thaliana, the AtDYW1 gene encodes a protein made of a targeting signal to the organelles and a DYW domain. Mutant lines in which this gene has been targeted for knock-down exhibit strongly altered development. In the affected seedlings, AtDYW1 gene expression is specifically decreased, and several editing defects in plastids transcripts were characterized.Taken together, these data support the hypothesis that the DYW domain and the AtDYW1 protein may be the central enzyme in the RNA editing.
Source: http://www.theses.fr/2008EVRY0010/document

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Université d’Evry Val d’Essonne University of Western Australia






Ecole doctorale : « Des génomes aux organismes School of Biomedical, Biomolecular
and Chemical Sciences


THESE EN COTUTELLE

présentée pour l’obtention du grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE D’EVRY VAL D’ESSONNE

et le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE WESTERN AUSTRALIA

Spécialité : Biologie cellulaire et moléculaire



IDENTIFICATION DU FACTEUR CATALYTIQUE DU PROCESSUS
D’EDITION DES ARN DES ORGANITES CHEZ LES PLANTES



Présentée par

Véronique SALONE



Soutenance publique prévue le 18 juillet 2008


Composition du jury

QUETIER Francis Directeur de l’école doctorale et représentant de l’Université d’Evry Val d’Essonne
LURIN Claire Directeur de thèse
SMALL Ian Directeur de thèse et représentant de l’Université de Western Australia

DUJARDIN Geneviève Rapporteur
GUALBERTO José-Manuel Rap
SCHMITZ-LINNEWEBER Rapporteur
















« C’était impossible. Ils ne le savaient pas. Ils l’ont fait. »

J. Cocteau



Remerciements


Je suis très reconnaissante envers mes directeurs de thèse Claire Lurin et Ian Small pour m’avoir confié
ce projet de doctorat et m’avoir permis de le mener à bien.

Je remercie Michel Caboche pour son accueil à l’URGV ainsi que, Volker Knoop, Charles Bond et
Geneviève Dujardin pour leur collaboration.

Je tiens à remercier également l’ensemble des membres du jury d’avoir accepter de juger ce travail, ainsi
que les membres de mon comité de thèse pour leurs conseils avisés.

Je remercie les organismes qui ont participé au financement de mon doctorat : le CNRS, l’INRA, la
FRM, l’université d’Orsay et l’université de UWA.

Merci à tous mes collègues d’Evry et Perth qui ont œuvré au bon déroulement des expérimentations, en
particulier Laure Heurtevin, Jean Colcombet, Etienne Delannoy, Cathie Colas des Francs-Small, Anne-
Laure Chateigner-Boutin, Will Stanley, Andéol Falcon de Longevialle et José Gualberto…

….mais aussi un petit clin d’oeil à Jessica Maciel, Sabine Genet, Jenny Gillett, Jude Moyle, Daniel
Wipf, Delphine Jublot, Elodie Piednoir, Kristen Feher, Kristina Kühn et Etienne Meyer…

….et une grande mention toute spéciale à Bénédicte Sturbois, Karoline Eifler, et Anne Bersoult …

Enfin je tiens sincèrement à remercier les personnes qui m’ont soutenu dans cette aventure et toutes les
autres…. Je pense tout particulièrement à mes parents, Michel, Yann, Hélène, Timothée et Pauline; et
mes amis Théodora, Xavier, Renaud, Arnold, les zap’l’d’air, les petits et grands du CJNA…

Merci aussi à tous ceux que je n’ai pas nommé mais qui se reconnaîtront….

Sommaire

Sommaire

Principales abréviations utilisées : ......................................................................................... 7 
Introduction ........................................................................................................ 9 
Partie 1 : ....................................................................................................... 10 
L’EDITION DES ARN ................................................................................ 10 
I. Généralités ..................................................................... 10 
I.1 Définition ........................................................................................ 10 
I.2 Différentes espèces ; différents processus ...................................... 11 
II L’édition par insertion ou délétion de nucléotides : Exemple chez les trypanosomes . 12 
II.1 Généralités ..................................................................................... 12 
II.2 Le clivage par une endonucléase ........................................................................... 13 
II.3 La délétion d’uridines par une exonucléase .......................................................... 13 
II.4 L’ajoût d’uridines par une TUTase (pour Terminal RNA UridylylTransferase) .. 14 
II.5 La ligation .............................................................................................................. 14 
II.6 Rôle d’une Hélicase ....................................................................... 15 
II.7 Autres protéines du complexe 20S éditosome ....................................................... 15 
II.8 Autres protéines et complexes impliqués dans l’édition .........................16 
II.9 Conclusion ..................................................................................... 17 
III L’édition des ARN messagers nucléaires par conversion de nucléotides ................... 17 
III.1 L’édition C-en-U du transcrit de l’apolipoprotéine B (apoB) chez les vertébrés 18 
III.1.1 Le gène apoB produit, par un processus d’édition C-en-U de son transcrit,
deux protéines différentes ........................................................................................ 18 
6666III.1.2 Spécificité de reconnaissance du nucléotide C à désaminer ......18 
III.1.3 Le complexe d’éditosome ............................................................................. 19 
III.1.4 Pour résumé ................................................................................................... 23 
III.2 L’édition A-en-I des ARNm chez les animaux .................................................... 23 
III.2.1 Généralités ..................................................................................................... 23 
III.2.2 La famille de protéines ADARs .................................................................... 24 
III.2.3 Interaction des protéines ADARs avec leur ARN substrat ........................... 24 
III.2.4 L’activité catalytique des protéines ADARs ................................................. 27 
III.2.5 Rôle in vivo des protéines ADARs ............................................................... 28 
III.2.6 Cas particulier des désaminations A-en-I dans les ARNt ............................. 32 
III.2.7 Bilan général sur les désaminations A-en-I ................................................... 34 
III.3 Histoire évolutive des enzymes d’édition des ARN ............................................. 34 
III.3.1 La superfamille des désaminases zinc-dépendantes ...................................... 34 
III.3.2 Corrélations structure-fonction au sein des désaminases .............................. 35 
IV Le processus d’édition chez les plantes ...................................................................... 36 
IV.1 Généralités (Takenaka et al., 2008) (figure n°20) ................................................ 36 
IV.2 Quel avantage évolutif à l’édition des ARN des organites chez les plantes ? ..... 37 
IV.3 Comment une cytidine spécifique est reconnue dans un transcrit pour être
modifiée ? ..................................................................................................................... 39 
IV.3.1 Une région d’ARN indispensable (dit «cis-élément ») pour la reconnaissance
du site d’édition ................................................................................ 39 
IV.3.2 Existence de signaux plus éloignés (séquences « enhancer ») et effets longue
distance ..................................................................................................................... 40 
IV.3.3 Un facteur agissant en trans dans le processus d’édition ................41 
IV.4 Quelle (s) enzyme(s) sont impliquées dans l’édition chez les plantes ................. 42 
IV.4.1 Est-ce qu’une cytidine-désaminase est impliquée dans l’édition ? .42 
1Sommaire
IV.4.2 Est-ce qu’une transaminase est impliquée dans l’édition ? ........................... 43 
IV.4.3 Est-cee CTP synthase est impliquée dans l’édition ? ......................... 44 
IV.4.4 Quelle(s) autre(s) enzyme(s) pourraient être impliquée(s) dans l’édition ? .. 44 
V Bilan sur l’édition des ARNs ........................................................................................ 45 
V.1 Avantages et conséquences de ce mécanisme .........................................45 
V.2 Origine et évolution de ce processus ..................................................................... 45 
Partie 2 : ................................................................................ 46 
LA FAMILLE DE PROTEINES PPR (pour pentatricopeptide repeat) ............................... 46 
I Caractéristiques des protéines PPR .................................................................46 
I.1 Mise en évidence d’une grande famille de protéines adressées aux organites chez
Arabidopsis ............................ ......................... ............... 46 
I.2 Le motif PPR : une séquence de fixation (spécifique) aux ARN ........................... 47 
I.3 Distribution phylogénétique des protéines PPR et caractérisation de différents
motifs ............................................................................................................................ 48 
I.4 Quelques données sur l’expression des protéines PPR chez Arabidopsis .............. 48 
II Rôle des protéines PPR ...........................................................49 
II.1 PPR et initiation de la transcription des ARNm .................................................... 49 
II.2 PPR et maturation des ARNm .........................................49 
II.3 PPR et traduction .......................................................................... 50 
II.4 Rôle de protéines PPR dans des mécanismes de régulation de l’expression des
gènes propres aux plantes ............................................................................................. 51 
II.5 Principales conclusions quant aux rôles des protéines PPR (figure n°26) ............ 53 
III Présentation du sujet de thèse : « Identification du facteur catalytique impliqué dans le
processus d’édition des ARN des organites chez les plantes » ........................................ 53 
Présentation des résultats ................................................................................. 55 
Partie 1: ......................................................................................................... 56 
DES DONNEES EN FAVEUR DE L’IMPLICATION DU DOMAINE DYW DANS LE
MECANISME D’EDITION DES ARN CHEZ LES PLANTES ........................................ 56 
I Une hypothèse à tester ................................................................................................... 56 
II Deux approches parallèles pour tester notre hypothèse ................................................ 57 
II.1 Mise en évidence et caractérisation de similarités entre le site actif de cytidines
désaminases et le domaine DYW ................................................................................. 57 
II.1.1 Des conservations de séquences primaires entre le domaine DYW et les
désaminases ....................................................................................... 57 
II.1.2 Le motif catalytique des CDA est comparable à un motif conservé du
domaine DYW .................................................................................. 57 
II.1.3 Des conservations de structures secondaires entre le domaine DYW et les
cytidines désaminases .............................................................................................. 58 
II.1.4 Bilan ................................................................................................................ 58 
II.2 Une étude de la distribution du domaine DYW dans le règne végétal .................. 58 
II.2.1 Une analyse bioinformatique ....................................58 
II.2.2 Mise au point d’une approche par PCR à l’aide d’amorces dégénérées ........ 59 
II.2.3 PCR à l’aide d’amorces dégénérées sur l’ADN génomique d’espèces
d’intérêts ................................................................................................................... 59 
II.3 “A hypothesis on the identification of the editing enzyme in plant organelles” ... 60 
III Etude complémentaire : recherche de la présence éventuelle du domaine DYW chez
les dinoflagellées. ............................................................................................................. 61 
III.1 Contexte de l’étude ............................................................................................... 61 
III.2 Recherche de la présence du domaine DYW chez les dinoflagellées .................. 61 
III.3 Validation de la présence d’une PPR de type DYW chez Karenia brevis ........... 62 
2Sommaire
III.4 Bilan ..................................................................................................................... 62 
IV Discussion ................................................................................................................... 63 
Partie 2: ................................................................................ 66 
LE CANDIDAT AtDYW1 ................................................... 66 
I Contexte de l’étude ................................................................................ 66 
II Rôle putatif de AtDYW1 : une hypothèse de travail .................................................... 66 
III Une annotation corrigée pour le locus At1g47580 ...................................................... 67 
IV Localisation subcellulaire de la protéine AtDYW1 ........................... 68 
IV.1 Analyses bioinformatiques ............................................................ 68 
IV.2 Etude de la localisation subcellulaire de protéines de fusion ................68 
IV.3 Expériences de western blot utilisant l’anticorps anti-AtDYW1 ......................... 68 
V Interprétations et Bilan ................................................................................................. 69 
Partie 3: ........................................................................................................ 71 
UNE ETUDE GENETIQUE DU GENE AtDYW1 ...................................... 71 
I L’approche génétique : les grandes lignes ..................................................................... 71 
II Mutants d’insertion ............................................................................... 71 
II.1 Contexte de l’étude ..........................................................71 
II.2 Phénotype macroscopique des plantes de génération T4 des lignées SALK-123655
et SALK-012425 .......................................................................................................... 72 
II.3 Génotypage des plantes de génération T4 des lignées SALK-123655 et SALK-
012425 .......................................................................................................................... 72 
II.3.1 Principe du génotypage .................................................................................. 72 
II.3.2 Résultats des réactions de PCR ...............................72 
II.4 Que signifie l’absence de plantes homozygotes en génération T4, dans la lignée
SALK-012425 ? ........................................................................................................... 73 
II.5 Discussion sur l’absence de mutants d’insertion ....................................74 
III Lignées « ARNi » ................................. 74 
III.1 Le projet AGRIKOLA ......................................................................................... 74 
III.2 Lignées « ARNi » constitutives ........................................................................... 75 
III.2.1 Etablissement des lignées « ARNi » constitutives ........................................ 75 
III.2.2 Sélection et génotypage des lignées .............................................................. 76 
III.2.3 Caractérisation phénotypique des 12 lignées d’intérêt .................................. 76 
III.2.4 Bilan .............................................................................................................. 76 
III.3 Lignées « ARNi » inductibles de première génération 78 
III.3.1 Contexte de l’étude ........................................................................................ 78 
III.3.2 Etablissement des lignées « ARNi » inductibles de première génération ..... 78 
III.3.3 Sélection, génotypage et phénotypage des transformants T1 ....................... 78 
III.3.4 Analyse phénotypique des lignées AtDYW1 « ARNi » inductible à la
génération T2 ............................................................................................................ 79 
III.3.5 Efficacité de l’induction via la dexaméthasone .......80 
III.3.6 Niveau d’expression du gène AtDYW1 dans les lignées « ARNi »
inductibles ................................................................................................................ 82 
III.3.7 Recherche de défauts d’édition dans les lignées « ARNi » inductibles 1 et 4
................................................................................... 85 
III.3.8 Bilan et interprétations des résultats .............................................................. 89 
III.4 Lignées « ARNi » inductibles de deuxième génération ....................................... 92 
III.4.1 Etablissement des lignées « ARNi » inductibles de deuxième génération ... 92 
III.4.2 Génotypage et phénotypage de plantes issues des croisements .................... 94 
III.4.3 Validation de l’efficacité d’induction à la dexaméthasone ........................... 94 
III.4.4 Niveau d’expression du gène AtDYW1 après 21 jours d’induction ............. 95 
3Sommaire
III.4.5 Bilan .............................................................................................................. 95 
III.5 The Arabidopsis AtDYW1 protein: a key component of RNA editing machinery
in chloroplasts (manuscript en préparation) ................................................................. 96 
IV Mutants surexprimant la protéine AtDYW1 ....................................... 97 
IV.1 Contexte de l’étude ...................................................................... 97 
IV.2 Mutant de surexpression de première génération ......................... 97 
IV.2.1 Etablissement des lignées de surexpression .................................................. 97 
IV.2.2 Sélection des transformants obtenus ...............................................97 
IV.2.3 Phénotypage et génotypage des 29 lignées en génération T2 ....................... 99 
IV.2.4 Analyse des lignées de surexpression en T3 ..........99 
IV.2.5 Bilan et interprétations des résultats ........................................................... 101 
IV.3 Mutant de surexpression de deuxième génération .................................102 
IV.3.1 Etablissement des lignées de surexpression de deuxième génération ......... 102 
IV.3.2 Sélection et génotypage des transformants obtenus ............ 103 
IV.3.3 Caractérisation phénotypique des transformants obtenus ...............103 
IV.3.4 Etude de l’expression du gène AtDYW1 par des expériences de PCR
quantitative sur les plantes de génération T1 ......................................................... 103 
IV.3.5 Recherche de défauts d’édition sur les plantes de génération T1 : Analyse par
PPE ................................................................................................. 104 
IV.3.6 Etude de l’expression du gène AtDYW1 : expériences de western blot sur
des plantes de génération T2 .................................................................................. 104 
IV.3.7 Bilan et interprétations des résultats ......................105 
Partie 4: ..................................................................................................... 106 
UNE ETUDE « FONCTIONNELLE» DE LA PROTEINE AtDYW1 ............................. 106 
I Les objectifs de l’approche .....................................................106 
II Production de la protéine AtDYW1 en système bactérien ......................................... 106 
II.1 Construction utilisée ............................................ 106 
II.2 Expression de la protéine rDYW1 en système bactérien ........................107 
II.3 Production d’un anticorps dirigé contre la protéine AtDYW1 ............................ 107 
II.4 Optimisation de la production de protéine rDYW1 soluble ................................ 108 
II.5 Purification de la protéine rDYW1 .........................................................109 
II.5.1 Chromatographie d’affinité : utilisation du système Ni-NTA (Quiagen) ..... 109 
II.5.2 Chromaie par échange d’ions ........................................................... 109 
II.5.3 Identification des « contaminants » par spectrométrie de masse ......110 
II.6 Tests préliminaires afin d’évaluer, par spectrophotométrie à dichroïsme circulaire,
la « renaturation » de la protéine rDYW1 .................................................................. 110 
III Production de la protéine rDYW1 en système in vitro .........110 
III.1 Généralités sur la technologie RTS (Rapid Translation System) ....................... 111 
III.2 Production à partir d’un extrait d’E. coli (ou E. coli system) ou de germe de blé
(Wheat Germ system) ................................................................................................. 111 
IV Bilan de la production de la protéine AtDYW1 ...................112 
V Une étude « fonctionnelle » de la protéine AtDYW1 ................................................ 113 
V.1 Mesure d’une activité cytidine-désaminase par spectrophotométrie ......113 
V .2 Mise en évidence d’une activité cytidine-désaminase sur sondes d’ARN radio-
marquées ..................................................................................................................... 114 
V.2.1 Description générale du test utilisé .........................114 
V.2.2 Mise en place de ce test pour évaluer une éventuelle activité cytidine-
désaminase de la protéine AtDYW1 ...................................................................... 115 
V.2.3 Résultats et interprétations ................................................... 116 
V.3 Reconstitution d’un complexe « minimal » d’édition ................. 117 
4Sommaire
V.3.1 Objectifs de l’approche ................................................................................ 117 
V.3.2 Reconstitution d’un complexe « minimal » d’édition dans les mitochondries
de levure : ............................................................................................................... 117 
V.3.3 Reconstitution d’un complexe « minimal » d’édition en cytoplasme de
cellules de N. benthamiana ............. 118 
V.4 Bilan sur la recherche d’une activité cytidine-désaminase pour la protéine
AtDYW1 .................................................................................................................... 121 
Discussion générale ........................................................................................ 123 
I Le modèle d’étude : un bref rappel ............................... 124 
II Résultats obtenus en faveur du modèle .................................124 
II.1 Des arguments phylogéniques en faveur du modèle ........................................... 124 
II.2 Des arguments génétiques en faveur du modèle ................................................. 125 
III Des interrogations quant au modèle .................................................. 125 
III.1 Le domaine DYW et la protéine AtDYW1 sont-ils des facteurs enzymatiques
dans la réaction d’édition ? ................................................................ 125 
III.2 Le modèle est-il valable pour les deux organites ? ............................................ 126 
III.3 Combien de protéines PPR sont impliquées dans l’édition ? ............................. 127 
III.4 Les protéines PPR de type PLS sont –elles des facteurs de spécificité dans le
processus d’édition? ................................................................................................... 127 
III.5 Combien de séquences « cis- élément » une protéine PPR de type PLS peut-elle
reconnaître ? ....................................................................................... 129 
IV Perspectives ....................................... 129 
IV.1 Des données qui pourraient compléter le manuscrit en préparation .................. 129 
IV.2 Autre perspective : vers une meilleure compréhension de l’interaction PPR/ARN
substrat ....................................................................................................................... 131 
V D’autres pistes de travail .................................................................... 132 
V.1 Vers une compréhension de l’origine et de l’évolution des protéines PPR, du
domaine DYW et de la protéine AtDYW1 ................................................................ 132 
V.2 Edition des ARNt dans les organites des plantes ................................................ 133 
V.3 Edition dem nucléaires? ...............134 
V.4 Une expression des protéines PPR et de la protéine AtDYW1 extrêmement
régulée dans la cellule végétale .................................................................................. 134 
VI Une « critique » de l’approche menée au cours de mon doctorat ............................. 136 
VI.1 Le danger du modèle .............................................................................136 
VI.2 Et si c’était par la fin que tout commençait… ................................................... 137 
Matériel et méthodes ............................................................... 138 
I. Matériel biologique .................................................... 139 
I.1 Les espèces végétales ................................................................................139 
I.2 Les souches des bactéries ............. 139 
I.3 Conditions de croissance et milieux de culture .........................................140 
I.3.1 Culture des plantes Arabidopsis thaliana et Nicotiana benthamiana sur terreau
................................................................................................................................ 140 
I.3.2 Culture des plantes thaliana in vitro .......................................... 140 
I.3.3 Culture des souches de bactéries ................................140 
I.4 Autre matériel ............................................................................... 141 
II Méthodes de biologie moléculaire .............................................................................. 141 
II.1 Méthodes relatives à l’ADN ....................................................... 141 
II.1.1 Extraction d’ADN génomique « rapide » d’Arabidopsis ............................. 141 
II.1.2 Echantillons d’ADN génomique provenant d’autres espèces ...................... 142 
II.1.3 Amplification d’ADN par PCR ........................................................143 
5Sommaire
II.1.4 Visualisation des produits PCR par électrophorèse ...................................... 144 
II.1.5 Purification de produits PCR en vue d’un clonage ou d’un séquençage ...... 145 
II.1.6 Clonage de produit PCR ............................................................................... 145 
II.1.7 Transformation bactérienne, sélection et test des colonies transformantes .. 150 
II.1.8 Tranformation d’Agrobactéries, sélection et test des colonies transformantes
................................................................................................................................ 150 
II.1.9 Extraction et purification de plasmide (miniprépration d’ADN) ................. 151 
II.1.10 Séquençage d’ADN ............. 151 
II-2 Méthodes relatives à l’ARN ................................................................................ 152 
II.2.1 Extraction d’ARN total de tissus végétaux ................................................... 152 
II.2.2 Elimination de l'ADN contaminant des extraits d'ARN totaux .................... 152 
II.2.3 Réaction de transcription « inverse » ........................................................... 153 
II.3 Mesure du niveau d’édition ................................................................................. 153 
II.3.1 Crible HRM (pour High Resolution Melting) ..........153 
II.3.2 Analyse par PPE (pour Poisoned Primer Extension) .................................... 154 
III Méthodes relatives aux protéines .............................................................................. 156 
III.1 Extraction de protéines de tissus végétaux ......................................................... 156 
III.2 Dosage de protéines ........................................................................................... 156 
III.3 Migration des protéines sur gel dénaturant ........................................................ 156 
III.4 Expériences de western blot ............................................................................... 157 
III.5 Production de la protéine rDYW1 en système bactérien ................................... 158 
III.6 Production de la protéine rDYW1 par le système RTS (Rapid Translation System,
Roche) ........................................................................................................................ 159 
III.7 Purification de la protéine rDYW1 .................................................................... 159 
III.7.1 Par le système Ni-NTA, pour Nickel-Nitrilotriacetic acid (Qiagen) .......... 159 
III.7.2 Chromatographie d’échange d’ions ............................................................ 160 
III.8 Production d’anticorps polyclonaux ................................................................... 160 
III.9 Essais de renaturation de la protéine rDYW1 par dichroïsme circulaire ........... 161 
III.10 Mesure de l'activité cytidine-désaminase par spectrophotométrie ................... 161 
III.11 Test d’édition sur sondes d’ARN radiomarquées ............................................ 161 
IV Méthodes de biologie cellulaire ................................................................................ 163 
IV.1 Expression transitoire de protéines en cellules de Nicotiana benthamania par
agroinfiltration .................................................................................... 163 
IV.2 Obtention de protoplastes et observations microscopiques ............................... 163 
V Méthodes propres à Arabidopsis ....................................................................164 
V.1 Transformation d’Arabidopsis par « floral deeping » ................. 164 
V.2 Croisement d’Arabidopsis .................................. 164 
V.3 Etude du phénotype ............................................................................................. 164 
V.4 Coloration de grains de pollen, méthode d’Alexander (Alexander, 1969) ......... 164 
V.5 Détection de l’activité GUS par coloration directe de plantules d’Arabidopsis . 165 
V.6 DétectioUS par fluorimétrie ...................................................... 165 
VI Outils bioinformatiques ............................................................................................. 166 
Annexes .................................................................................. 167 
Annexe N°1 : Liste des principaux plasmides et vecteurs d’expression utilisés ....... 168 
Annexe N°2 : Liste des principales constructions réalisées au cours de mon doctorat
.................................................................................................................................... 169 
Annexe N°3 : Liste des principaux oligonucléotides utilisés ..................................... 171 
Annexe N°4 : Code d’utilisation des bases dégénérées .........177 
Références Bibliographiques .............................................................................................. 178 
6Abréviations
Principales abréviations utilisées :



AC : AntiCorps
ACF : APOBEC1 Complementation Factor
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ADNc : ADN complémentaire
ADNg : ADN génomique
AGRIKOLA: Arabidopsis Genomic RNAi Knock-out Line Analysis
AID: Activation-Induced cytidine Deaminase
apoB : apolipoprotéine B
APOBEC1 : apoB mRNA editing catalytic component 1
ARN : Acide RiboNucléique
ARNg : ARN guide
ARNm : ARN messager
ARNi : ARN interférent
ARNt : ARN de transfert
ARNr : ARN ribosomique
ADAR : Adenosine DeAminases that act on RNA
ADAT: Adenosine DeAminases that act on tRNA

BLAST : Basic Local Alignment and Search Tool

CATMA: Complete Arabidopsis Transcriptome MicroArray
CDA : Cytidine DésAminase
CMS : "Cytoplasmic Male Sterility", stérilité mâle cytoplasmique

dNTP : désoxyribonucléotide
Ds-RedII ou RFP : Red Fluorescente Protein
DYW : domaine C-terminal de certaines protéines PPR

GFP : Green Fluorescente Protein
GST: Gene-specific Sequence Tag
GUS : ß-glucuronidase

hpRNA : hairpin RNA ou ARN en épingle à cheveu
HRM: High Resolution Melting

IPTG: Isopropyl-Beta-Thio-Galactoside

miARN : microARN
MS (1/2MS) : milieu Murashige et Skoog

NAD(P) : forme oxydée de la Nicotinamide Adénine Dinucléotide (Phosphate), NAD(P)H
pour la forme réduite
NCBI : National Center for Biotechnology Information
Ni-NTA : Nickel-Nitrilotriacetic acid
NLS : séquence de localisation nucléaire
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