In vitro and in vivo applications of fluorescence cross-correlation spectroscopy [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Wolfgang Staroske

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orenDoDissertationfürorgelegtBiophJuniysikakF(Dr.acolfganghric28.hectroscoptungErlangungPhhenysikrerumFnat.)akultätonfüreMathematikErfurtundebruarNaturwissenscInstituthaftenyTzurecdeshniscademischeGradesUnivctorersitätnaturaliumDresdenrer.InvVitrovandWInStaroskVivogebApplicationsinofamFluoFrescence1978Cross-Co2010rrelationSpFirstProf.SecondReferee:JörgProf.willeDr.Referee:PDr.etraEnderleinSchtoevyFluorescencebcorrelationhineryspdeectroscopyyery(FresultsCS)dierenanalyzesthetheinuctuationsshortinothedicationsuorescencehi-inAtensiteralyconsists,rotation.whicparticlehregionsisofemitteddual-colorfromwhicaDuetintialyinexcitionhemicalvpresenolume,thetoyobtainofinformationyabboutblytheassaconcenotration,oppthepatternmobilittheythe,particlesandetheInmolecularmecinasteractionsvivo.ofgenelabdouble-strandedeled(siRNAs),molecules.ecicitTheamoretherapadveuticancedofuorescenceedcross-correlationsomespsilencingectroscopassayto(FstepsCCS)eryincreasesinthevprecisionRNAiinetthemacdeterminationCCSofTheodicationswofvvelopatterncitiestandorticesbindingsizeconstandirectiontsocomparededtoCCSstandardedFjectoriesCS.

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Published 01 January 2010
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Institutf?rBiophysikrerumErfurtErlangungFonacectroscophrichenhnat.)tungePhebruarysikDissertationFakakult?tDof?r(Dr.MathematikorgelegtundolfgangNaturwissenscorenhaften28.TJuniecyhnisczurhedesUnivademiscersit?tGradesDresdenctorInnaturaliumVitrorer.andvInvVivoWApplicationsStaroskofgebFluoinrescenceamCross-CoFrrelation1978Sp2010FirstReferee:Prof.Dr.J?rgSecondProf.PwilleetraReferee:ScDr.hEnderleinAbstractFluorescencecorrelationolutionarystudy2f-Fspeectroscopwyarra(F,CS)wanalyzesfromthetuctuationsaccuminterferencetheinuorescencebroadenininhibittensitneryydirect,cwhicofhTheistraemittedabfromthisaFtinhytoexcitionforvvivoolume,mototedobtainindividualinformationandabtheoutoftheeconcenandtration,ys.thevmobilitositeyderiv,observandforcetheinmoleculartheintheteractionshanismofstudiedlabRNAieledsilencingmolecules.RNATheasmoreyadvgreatancedeuticuorescenceapplica-cross-correlationsiRNAsspbectroscopofymec(FysCCS)inincreasesofthehighprecisionrealinagethemacdeterminationwofhineryomeasuremenwinuencevonelothecitiesestigatedandthatbindingwconstanoftsandcomparedoftowstandardbFexplainsCS.complexTheinminiaturizationandinofbiomedicalell-denedandvcelectrohemical.engineeringparthasthebRNAeenwdevyelopinginra-anpidlyed,hanism,propshortelledcalledbRNAsymolecules.thespvisionsimplicitofyieldsaotenfullywidespreadfunctionalTlabtheraporatorytheonyatosinglevcchipbutandmoitsgeneuseTheinCCShvumansuitedtherapestigateeutics,blyformacexample,vasecicitimplanytedanddrugcleadelivyeryatedsystem..AbkactiviteyRNAirequire-themenFtcouldtown.fulllsevthismovisionassemisythemacabilitinythesetopatternhandleconsistssmalltuidovorticesolumes.dierenHandlingsizeliquidsoppusingdirectiontherotation.electrohoydropatterndynamicaledprincipleycircumCCSvtheenedtsparticlemanjectoriesytheofeldthethedisadvulationanparticlestageswofregionsotherosystems.eThemicrocomplexdeoywInpatternsecondinofthethesis,activmeceofregioninof(RNAi)sucashbadual-colorpumpCCScouldvivo.notisbeveconservresolvgeneedmecbwhicyusescommondouble-strandedtracmolecules,kingshorttecterferinghniques.(siRNAs),IneectorthisDuethesis,itstecicitwando-foycusRNAiFaCCSp(2f-FtialCCS)awtherapasuse.usedotothemapeuticthetions,oinwstabilitproleofinsidehasabmicropump.improTheedhighyprecisionhemicalofdications,2f-FsomeCCStheseindicationsthethedeterminationsilencingofhanism.opresenwFmeasuremenassatsareeveryenellwithtosmallvuorescenthetassemparticlesstepsalloRNAiwhi-edwiththeerymeasuremensptyofsensitivittheinotimewtovtheelovcitiesactivitinducedofbactivyRNAielectrohhineryydroAdynamiccorrelationforcesetactingeenonythethesolvmacenandt,resultswhiletheexcludingCCSthetseectsbofshodielectrophoreticTheforcesofactingeralonhemicallargerdicationsparticles.theAnalysisblyofactivittheofoRNAiwhinerydataasindicatesvawithoassawiKurzfassungInvitroZellenEmp-zwundErwinZusammenvivoherungAnwkurzeendungenerderhenFluowirkreszenz-KreuzkDiesesoImrrelation-SpeinektroskRNAiopiemittelsFluoreszenz-Kgutorrelations-Spdieektroskerden.opietersuc(FderCS)hiedlicanalysierteilcdieBereicFluktuationenwurdeimtersucFluores-kurzezenzsignalutzt.einesinkleinendieangeregtenerh?hen.Vorgestelltenolumens,ZusammenumEcInformationenstudieren.?bdenercdiehinerieKgr??ereonzenhentration,dasdiegegengesetztBewelnegungdieundegungsbahnendiehenIndenteraktioneneilderusmarkiertenarbMolek?leInzuGeninaktivierungsmecerhalten.Molek?le,Die(siRNAs),Fluores-undzenz-Kreuzkworrelations-Spt?senektroskeldesopieim(FMoCCS)dikerh?hus.terimendieeinzelnenGenauigkMasceitundbuneiMa-derteMessungRNAivCCSononFlie?gescdikhAktivit?twindigkneuartigeneitenderundeilcBindungskdielektropho-onstanDietenergab,imungsbildVenergleicunhgro?enzurestehStandard-FungsbildCS.ompliziertenDiebMiniaturisierungdiederTBiomedizinklarund?bChemieelektrohateitensicArbhRNAi-MecrapidelebenZwtCCSwict.k(RNAi)elt,olution?rangetrie-us,belstr?ngigeengenann-vterferierendeonEektormolek?lederSpVisionhheiteinesihrkFomplettenmedikLabge?net.orsdiesesaufeseinemderChip?rpundhemiscdemationenEinsatzdieserdieseshemmeninRNAi-MecderhiermediziniscCCShensindTherapie,umzumhritteBeispielderalsmitimplanhktierterezit?tMediktzeitamenhentenspderender.hinerieEinkScZusammenhanghl?sselelemenAktivit?tthineriezurderErf?llunghergestelltdieserEinussVisionerscisthenderaufTundranspRNAiortmitvdenont.kleinstenaufFl?s-TsigkheneitsmengenendeninretiscdiesenKr?fte.miniaturisiertenAnalyseSystemen.DatenDerdassTStr?mranspausorteivt-onrotierendenFl?ssigktersceitenhmittelsWirbdesbelektroht.ydroStr?mdynamiscerkl?rthenkPrinzipsTumgehhentewvieleundNacAnreichderteileeilcvinonabgegrenztenanderenhenSys-ertemen,Mikroallerdingsden.zeigtzweineTsolcdieserheeitPumpderehanismeininkendenompliziertesmittelsStr?mei-Fungsbilden-FinunderhaktivRNAenterferenzRegion,istwevelcerhaltenerheshanismsicderhdoppmitRNAherkso?mmlicteheninMethoRNAsdenalswienTDieeilcezit?thenEinfacvdererfolgunghatniceinheitesteldvderermes-amensenTherapielie?.ZurHiereiterungwurdeFZwistei-Fn?tigokus-FStabilit?tCCSsiRNAs(2f-FKCCS)ergencutzt,herumdikdaszuStr?mEinigeungsbildMoinationenderabPumpdenehanismzuDievvermessen.FDieExphoheteGenauigksehreitgeeignet,derdie2f-FScCCSdesbbauseiRNAiderhinerieBestimmhoherungndlicveitonSpFlie?-ingeschhzuwindigktersuceitenundaucAktivit?thRNAimitsckleinenzuuoreszierendenEsTonneilceinhenzwiscerm?glicderhderteMascdieundMessungErgebnissenderFFlie?gescMessungenhwwindigkDereiten,vaufgrundvderhiedenenaufhemiscdasMoL?sungsmittelationenwirkdenendenbauelektrohdieydro-derdynamiscMaschenwurdeKr?fte,diesenunMethoterunAusschhlussiiListofPublicationsmoentequallyArticlesolfgangrelatedetointothisctrthesisripletMaikholasamoFPelten,inhibitionWencolfgangcidsStaroskandethe,ys.MagnhusctiveS.nickingJaeger,MarkusPwille.etracicScausehdwille,orrandvivClausmitted).DuscMartinhl.Single-AncciencycumulationEmittingand(19),lteringDanielofarz,nanonpandarticlesationinculemicr*oorkchannelsthaler,usingScelechanisticc-osition-sptrsi-ohydrsiRNAsobydynamicationsaluorlycrinducspeopydNucleicvortichalPublicationsows.eElectrophoresisKarl29hael(14),T2987-2996nnihilation:(2008)LimitThomasBrightnessOhrtPhosphor*ganic,des.J?rgLett.M?tze(2007).*Hergen,FWholfgangolfgangStaroskSylviaeSeidel.,epLasseinternalWdeinmann,onstructsJulia(inH?concthisk,Crell,KarinLand-Crell,andGunetraterhMeister,MeandinsightsPpetraeScgenehlencingwille.withinFluorcescdenc2'-O-methylediccanalyzeorrbyelationescspeeoss-cc-elationtreoscoscopyinando.uorAescResearcenc(sub-eOthercrWoss-cStaroskorr,elationPfeier,spLeo,eMicctrHomann.oscStepopyriplet-TrAeveAalIntrinsictheforcytoplasmicHighorig-Ef-inationofofescloOradeLightdDionuclePharRev.RISC98in197402vivNicoLuzzietti,inBrutzer,humanKlaue,criedricelScls.wNucleicWAStaroskcids,Res.Clausing,36Ralf(20),Ee6439-6449pr(2008).arThomasofOhrtly*die,single-moleWcolfgangusingStaroskenzymes.epreparation).*authors,tributedJ?rgtoM?tze,wKariniiiContentsAbstracti.trolling.List.of.Publicationsofiiiw1.Intro.duction.andTimeOutliney1.2.Fluo.rescencePumpingCoCross-CorrelationrrelationRealizationSp.ectroscop.y.3.2.126In.tro.ductionw.In.............Considerations.........42.....Detector.....ectroscop.Fluorescence.Data.......3.Micro-Pump.F......3.2.2MicropumpPh.ysical.Basics..of...Man...w.......3.3.2.....41...................25.and.......2.6.6.Correlation4in2.2.1ArtifactsFluorescenceSp.27.aluation...............the.of.y.o.33.duction...............3.2......4.2.2.2.Diusion....3.2.1.ydro.....34.and.the...3.3.cus.the.3.3.1...........erimen...........Results......9.2.3.Theory.of.Fluorescence.CorrelationDiscussionSp.ectroscop.y..........46.....2.6.5.Afterpulsing9Dead2.3.1.Principle.of.Auto.correlation....26.Problems.Fluorescence.Sp.y.vivo.2.6.7.in.Cross-Correlation.ectroscop...2.7.Ev......9.2.3.2.Deriv.ation.of.the.Mo.del-F.unction.for.Auto.correlation30.Resolving.Flo.Prole12a2.4bTTwo-Fo-FcusoCCScus3.1FluorescencetroCross-Correlation.Sp.ectroscop.y.............17.2.5.Dual-Color.Fluorescence.Cross-Correlation.Sp33ectroscopThey...........19.2.6.Problems.and.Artifacts.in.Fluorescence.Correlation.Sp34ectroscopTheoryyElectroh21dynamic2.6.1.Optical.Artifacts.in.Fluorescence.Correlation3.2.2SpufacturingectroscopConyof21Micropump2.6.2.T.riplet36BlinkingTando-foSaturationFluorescence.inside.Micropump.38.Theoretical...................38.Exp23tal2.6.3.Uncorrelated.Bac.kground..............3.4......................24.2.6.4.Photobleac.hing......3.5.................................vContents3.6.79.Conclusion..Only...F.and.5'-end.......T.een...RNAi.v...Correlation...Conclusion.94.....64.vivo...y...5.3.3.of.y.3'-end...RNA47at4yRNAandInterference.49.4.1.The.Disco.volsery.ofMaterialRNA.In.terference..and.y.Studied...In.T.CCS.......for...siRNAs.5.4.1.Chemical.Mo.and49.4.2MoBiogenesislizationof.Small5.4.4RNAsSite.on...Silencing.sured...90.................Outlo.97.....63.Metho....51.4.2.1.Origin.of.LongRISCdsRNAsteraction.studied.CCS.5.3.1.y.....68.Bet.and.Studied.Color...............Mo.RISC51uttling4.2.25.4NuclearMoMaturationtoofhanismmicroCCSRNAsDieren.dications.Increased.on.Strand.arget-RNA.....5.4.3.on.to.the.teraction..51.4.2.3MoSmallvRNAvPronorcessingAinStrandthe88Cytoplasmw.ctivit.vivo.teraction.......Discussion......52.4.2.4.RISC.Loading.and91P.assenger.Strand.Separation..........Conclusion.9553Abb4.3101Gene.Regulation.b.y.Small.RNAs5.2.and.ds.........................5.3.Loading.In.with55arget4.3.1bTFargetinRecognition68.RISC-Loading.b.Dual-Color.CCS.........5.3.2.teraction.w.RISC.Its.arget.b.Dual-.F..........55.4.3.2.Messenger.RNA.Clea.v.age....72.Cellular.del.Human.Loading.Sh...76.Inuence.Chemical.died.on.the.Mec.79.F.Compatibilit56of4.3.3tTMoranslational.Repression5.4.2and2'-O-methylmRNAdicationsDegradationthe.Inhibit.Separation.T.Clea.age56.4.3.4.T.ranscriptional80Gene2'-O-methylSilencingdications.the.Lead.Destabi-.of.RISC-Guide.In.........86.2'-O-methyl.dications.Clea.age.Ha59e4.4Mi-ChemicalEectsMoSilencingdicationsctivit.and.Separation...5.4.5.Bet.een.A.y.in.Mea-.RISC-target-RNA-In...............5.5..........59.5.RNAi.Mechanism.studied.b.y.F.CCS.in.vivo.635.65.1.In.tro.duction..........................6.and.ok.Symb.and.reviations.Bibliography.viContentsAErkl?(Decla125cknorungwledgementsration)123viiviii