Intravenous anaesthetics inhibit nicotinic receptor-induced currents and Ca_1hn2_1hn+ transients in rat intracardiac neurons [Elektronische Ressource] / Martin Weber

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Intravenous anaesthetics inhibit 2+nicotinic receptor-induced currents and Ca transients in rat intracardiac neurons Martin Weber 2003 Dissertation submitted to the Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany for the degree of Doctor of Natural Sciences presented by Diplom-Psychologe Martin Weber born in: Schwäbisch-Hall Oral examination: Intravenous anaesthetics inhibit 2+nicotinic receptor-induced currents and Ca transients in rat intracardiac neurons Referees: Prof. Dr. Rainer H.A. Fink Prof. Dr. Michael Wink ISUMMARY The effects of intravenous (i.v.) anaesthetics on nicotinic acetylcholine receptor 2+ 2+(nAChR)-mediated transients in intracellular free Ca concentration ([Ca ]) and icurrents were investigated in neonatal rat intracardiac neurons using fura-2 photometry and patch-clamp recordings.

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Published 01 January 2004
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Intravenous anaesthetics inhibit
2+nicotinic receptor-induced currents and Ca transients
in rat intracardiac neurons















Martin Weber
2003




Dissertation
submitted to the
Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics
of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany
for the degree of
Doctor of Natural Sciences





















presented by
Diplom-Psychologe Martin Weber
born in: Schwäbisch-Hall
Oral examination:

Intravenous anaesthetics inhibit
2+nicotinic receptor-induced currents and Ca transients
in rat intracardiac neurons





















Referees: Prof. Dr. Rainer H.A. Fink
Prof. Dr. Michael Wink I
SUMMARY
The effects of intravenous (i.v.) anaesthetics on nicotinic acetylcholine receptor
2+ 2+(nAChR)-mediated transients in intracellular free Ca concentration ([Ca ]) and i
currents were investigated in neonatal rat intracardiac neurons using fura-2 photometry
and patch-clamp recordings. Extensive preliminary tests using fura-2 containing
solutions in the presence or absence of the anaesthetics were carried out to detect any
interference of these drugs with the fura-2 fluorescence signal: Using photospectrometry
and a ratiometric photometry set-up to carry out a series of calibrations of the fura-2
signal revealed that ratiometric fura-2 recordings can faithfully be carried out in the
presence of clinically relevant concentrations (clinical EC ) of the i.v. anaesthetics 50
studied. In fura-2 loaded neurons, nAChR activation evoked a transient increase in
2+[Ca ], which was reversibly inhibited by the clinical EC of the i.v. anaesthetic i 50
2+thiopental. The EC for thiopental inhibition of nAChR induced [Ca ] transients was 50 i
28 µM, close to the estimated clinical EC of thiopental (25 µM). However, control 50
2+ 2+experiments using Ca -channel blockers showed that voltage-gated Ca -channels
(Ca ) are activated by the depolarization following nAChR activation and thus indirectly v
2+contribute to increases in [Ca ]. When fura-2 loaded neurons were voltage-clamped at i
2+–60 mV to eliminate any contribution of voltage-gated Ca channels, then thiopental
2+simultaneously inhibited nAChR-induced increases in [Ca ] and peak current i
amplitudes. Thiopental inhibited nAChR-induced peak current amplitudes in dialyzed
whole cell recordings by ~ 40 % at –120, –80 and –40 mV holding potential suggesting
that the inhibition is voltage independent. Thiopental did not inhibit caffeine-induced
2+ 2+[Ca ] transients, indicating that an inhibition of Ca release from internal stores via i
ryanodine receptor (RyR) channels is unlikely. The barbiturate pentobarbital and the
dissociative anaesthetic ketamine used at clinical EC concentrations were also shown 50
2+to inhibit nAChR-induced increases in [Ca ]. In conclusion, thiopental and other i.v. i
2+anaesthetics may inhibit nAChR-induced currents and [Ca ] transients in intracardiac i
neurons by binding to nAChR and thereby may contribute to changes in heart rate and
cardiac output under clinical conditions.

2+Keywords: fura-2, intracardiac neurons, intracellular Ca , intravenous anaesthetics,
ketamine, nicotinic acetylcholine receptor, pentobarbital, ryanodine
receptor, thiopental.
III
ZUSAMMENFASSUNG
In dieser Arbeit wurde die Wirkung intravenöser (i.v.) Anästhetika auf intrazelluläre
Kalziumsignale und Membranströme, die durch die Aktivierung von nikotinergen
Acetylcholin-Rezeptoren (nAChR) entstehen, an neonatalen Herzganglienneuronen
untersucht. Als Untersuchungsmethoden wurden photometrische Messungen mit dem
Kalziumindikator Fura-2, sowie Patch-Clamp Messungen, teils auch in Kombination,
eingesetzt. In Voruntersuchungen mit Fura-2 -haltigen Lösungen wurde überprüft, ob
i.v. Anästhetika mit dem Farbstoff Fura-2 selbst interagieren. Mittels
Spektrophotometrie sowie einer Serie von Kalibrierungen des Fura-2 Signals am
Fluoreszenzmikroskop konnte gezeigt werden, dass Fura-2 Messungen in der
Anwesenheit klinisch relevanter effektiver Konzentrationen (klinische EK ) der 50
untersuchten Anästhetika zuverlässig durchgeführt werden können. In Fura-2
beladenen Neuronen führte die Aktivierung von nAChR zu einem vorübergehenden
2+Anstieg der intrazellulären freien Kalziumkonzentration ([Ca ]), welcher durch die i
klinische EK von Thiopental reversibel gehemmt werden konnte. Die Erstellung der 50
Dosis-Wirkungs-Beziehung von Thiopental auf die Hemmung nikotinerg induzierter
2+[Ca ] –Transienten ergab eine EK von 28 µM, die damit sehr nahe an der klinischen i 50
EK für Thiopental (25 µM) liegt. Weitere Kontrollexperimente unter Verwendung von 50
Kalziumkanal-Blockern zeigten jedoch, dass spannungsgesteuerte Kalziumkanäle durch
die Depolarisation, die durch die Aktivierung der nAChR entsteht, aktiviert werden und
2+somit indirekt zu nikotinerg induzierten Anstiegen der [Ca ] mit beitragen. Um diesen i
2+Beitrag der spannungsgesteuerten Ca -Kanäle zu eliminieren wurden im Rahmen
simultaner Fura-2 sowie Patch-Clamp Messungen Neurone mit einem Haltepotential
von –60 mV „geklemmt“. Es ergab sich eine simultane, Thiopental-induzierte
2+Hemmung der Amplituden von nikotinerg induzierten [Ca ] –Transienten und i
Einwertsströmen. In („dialyzed“) Patch-Clamp Messungen wurden die Amplituden
nikotinerg induzierter Einwertsströme bei –120, –80 und –40 mV Haltepotential jeweils
um ca. 40 % erniedrigt, was auf eine spannungsunabhängige Hemmung hinweist.
2+Thiopental hatte keine hemmende Wirkung auf Koffein-induzierte [Ca ] -Anstiege, i
was eine Hemmung von Ryanodin-Rezeptoren (RyR) durch Thiopental
unwahrscheinlich erscheinen lässt. Die klinische EK des Barbiturats Pentobarbital 50
sowie des dissoziativen Anästhetikums Ketamin hatten ebenfalls hemmende Wirkung
2+auf nikotinerg induzierte [Ca ] –Transienten. Dies lässt darauf schließen, dass es durch i
IV
die Wirkung von Thiopental und anderer i.v. Anästhetika am nAChR zu einer
Hemmung nikotinerg induzierter Ströme sowie intrazellulärer Kalziumsignale in
Herzganglienneuronen kommen kann, was wiederum zu Veränderungen der
Herzfrequenz sowie des Herzminutenvolumens, die bei der Verwendung dieser
Medikamente im Rahmen der Anästhesie zu beobachten sind, mit beitragen kann.

Stichwörter: Fura-2, Herzganglienneurone, intravenöse Anästhetika, intrazelluläres
2+Ca , Ketamin, nikotinerger Acetylcholin-Rezeptor, Pentobarbital,
Ryanodin-Rezeptor, Thiopental.