Mimicking the cellular environment [Elektronische Ressource] : effects of elastic nanopatterned substrates on integrin-mediated cellular interactions / put forward by Ilia Louban

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Dissertationsubmitted to theCombined Faculties for the Natural Sciences and forMathematicsof the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germanyfor the degree ofDoctor of Natural SciencesPut forward byDipl.-Phys. Ilia Loubanborn in Kiev, UkraineOral examination: November 4th, 2009Mimicking the Cellular Environment:e ects of elastic nanopatterned substrateson integrin-mediated cellular interactionsReferees: Prof. Dr. Joachim P. SpatzProf. Dr. Rainer FinkContentsAbstract 2I Introduction 31 Cells and their environment 51.1 The structure of a cell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61.2 The connective tissue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71.2.1 Extracellular matrix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81.3 Cell adhesion and environmental sensing . . . . . . . . . . . . . . . . 91.3.1 Integrins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101.3.2 Focal adhesions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121.3.3 Environmental sensing through focal adhesions . . . . . . . . . 142 Cells as biophysical model 192.1 Viscoelastic models . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192.2 Theory of adhesion and mechanosensing . . . . . . . . . . . . . . . . 222.2.1 Adhesion concepts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232.2.2 Physical model of mec . . . . . . . . . . . . . . . .

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Published 01 January 2010
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Dissertation
submitted to the
Combined Faculties for the Natural Sciences and for
Mathematics
of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany
for the degree of
Doctor of Natural Sciences
Put forward by
Dipl.-Phys. Ilia Louban
born in Kiev, Ukraine
Oral examination: November 4th, 2009Mimicking the Cellular Environment:
e ects of elastic nanopatterned substrates
on integrin-mediated cellular interactions
Referees: Prof. Dr. Joachim P. Spatz
Prof. Dr. Rainer FinkContents
Abstract 2
I Introduction 3
1 Cells and their environment 5
1.1 The structure of a cell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2 The connective tissue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2.1 Extracellular matrix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3 Cell adhesion and environmental sensing . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3.1 Integrins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.3.2 Focal adhesions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.3.3 Environmental sensing through focal adhesions . . . . . . . . . 14
2 Cells as biophysical model 19
2.1 Viscoelastic models . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2 Theory of adhesion and mechanosensing . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2.1 Adhesion concepts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2.2 Physical model of mec . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3 Motivation and objective 29
II Material and Methods 31
4 Nanopatterned PEG-DA hydrogels as ECM analog 33
4.1 Block copolymer micelle nanolithography . . . . . . . . . . . . . . . . 34
4.1.1 Preparation of nanopatterned surfaces . . . . . . . . . . . . . 34
iiiiv Contents
4.2 Poly(ethylene glycol)-diacrylate hydrogels . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.2.1 Transfer lithography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.2.2 Tuning particle size . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.3 Experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.3.1 Substrate preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.3.2 Scanning electron microscopy and cryo SEM . . . . . . . . . . 44
4.3.3 probey . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.3.4 Cell culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
III Characterization of elastic nanopatterned substrates 47
5 Combining BCMN and PEG-DA hydrogels 49
5.1 Characterization of nanopatterned surfaces . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.2 of PEG-DA hydrogels . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
IV Results 61
6 Cell spreading on elastic ECM analogs 63
6.1 General spreading behavior . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
6.2 Cell spreading on compliant substrates . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
6.3 Cellular spreading behavior in uenced by two-dimensional space of
environmental parameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
6.3.1 Quanti cation of cell spreading area . . . . . . . . . . . . . . . 71
6.3.2 Tactile set-points of mechanosensing . . . . . . . . . . . . . . 73
7 Single cell force spectroscopy on elastic nanopatterned ECM analogs 77
7.1 Principle of single cell force spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . 77
7.2 Quanti cation of cell adhesion forces on elastic nanopatterned sub-
strates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
V Conclusions and Outlook 85
8 87
9 Outlook 91
List of Figures 93Bibliography 95
Acknowledgments 112
A Appendix 113
A.1 Scanning electron microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
A.1.1 Cryo scanning electron microscopy . . . . . . . . . . . . . . . 114
A.2 Scanning probe microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
A.2.1 Atomic force spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
A.2.2 The Hertz model and indentation measurements . . . . . . . . 118
A.3 Abbreviations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
A.4 List of Publications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Reaktion von Zellen auf sich ver andernde
Umweltein uss e. Um dies zu untersuchen, wurde ein Substratsystem entwickelt, dessen
biomechanische und biochemische Eigenschaften deren der extrazellulare n Matrix des
Bindegewebes entsprechen. Die verwendeten Substrate basieren auf Polyethylenglykol-
Diakrylat (PEG-DA), dessen Elastizit at E innerhalb von vier Gr o enordnungen variiertY
werden kann (0.6 kPa < E < 6 MPa). Auf ihrer Ober ache wurden mit Hilfe derY
Block-Copolymer-Nanolithographie Goldnanopartikel gezielt in den Abst anden L (20
nm < L < 160 nm) angeordnet. Um die Adh asion der Zellen zu erm oglichen, wurden
die Partikel mit dem c(RGDfK) Peptid funktionalisiert, welches die Anbindung der Zellen
durch Integrine gew ahrleistet. Das Verhalten von Fibroblasten wurde als Funktion der
Substratelastizit at sowie des Abstandes der Nanopartikel ( L; E ) untersucht. Die In-Y
teraktionszeit der Zellen mit den Substraten betrug sechs, zw olf, bzw. 24 Stunden. Als
Reaktion wurde die zellul aren Fl achen mit Phasenkontrastmikroskopie sowie die Adh asion-
skraft mit Kraftspektroskopie quanti ziert. Die Experimente zeigten, dass ein Schwellw-
ert in der zellul aren Reaktion bezuglic h der Substratelastizit at ( E 8 kPa), sowie einY
anderer bezuglic h des Abstands der Bindungsstellen ( L 70 nm) existiert. Darub er
hinaus wurde festgestellt, dass die F ahigkeit der Zellen die mechanischen Eigenschaften
ihrer Umgebung wahrzunehmen, das "Mechanosensing", die dominante Komponente im
zellul aren Verhalten ist. Diese Erkenntnis tr agt demzufolge entscheidend zum besseren
Verst andnis der Zell-Zell und der Zell-Matrixinteraktion bei.
Abstract
In this work, the in uence of environmental parameters on cellular behavior has been in-
vestigated. Therefore, an arti cial substrate system, according to the biophysical and bio-
chemical properties of the extracellular matrix in connective tissues, has been developed.
The Young’s moduli E of poly(ethylene glycol)-diacrylate (PEG-DA) substrates spanY
more than four orders of magnitude (0.6 kPa <E < 6 MPa). Since PEG-DA substratesY
are protein repellent, they were decorated by quasi hexagonally ordered, extended gold
nanoparticle arrays, manufactured by block copolymer micellar nanolithography (BCMN).
To provide bioactivity in terms of cell adhesion c(RGDfK) peptide, which is speci c for
integrins, was immobilized on the nanoparticles. The interparticle spacing and,V 3
hence, spacing of integrin binding sites L could be precisely tuned, independently of the
substrate rigidity, between 20 nm and 160 nm. We investigated the behavior of broblasts
as a function of changes within this two-dimensional parameters space ( L;E ). To thisY
end, cell spreading area and cell-substrate interaction forces were determined by phase
contrast microscopy and single cell force spectroscopy (SCFS), respectively. The exper-
iments revealed two tactile set points, thresholds in cellular sensing behavior, at E Y
8 kPa and L 70 nm, after 6, 12, and 24 hours of adhesion, respectively. Moreover,
according to the hierarchical phase model in cellular behavior, elasticity was identi ed
to be the dominant parameter in cellular sensing processes. Thus, this work provides an
important contribution to the understanding of cell-cell and cell-matrix adhesion.