Molecular and functional analyses of transport proteins for organic anions [Elektronische Ressource] / presented by Valeska Reichel

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DISSERTATION submitted to the Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany For the degree of Doctor of Natural Sciences presented by Valeska Reichel, Pharmacist born in Bremen, Germany Oral examination: 13.02.2006 Molecular and Functional Analyses of Transport Proteins for Organic Anions Referees: Prof. Dr. Gert Fricker Prof. Dr. Ulrich Hilgenfeld Acknowledgements Special thanks go to Prof. Dr. G. Fricker for the interesting research subject, the support and the interesting discussions. I would like to thank Prof. Dr. U. Hilgenfeld for the second opinion and Prof. Dr. J. Reichling and Prof. Dr. U. Massing for beeing members of my defense committee. My gratidude goes to Dr. D.S. Miller for an interesting research period at the Mount Desert Island Biological Laboratory, the active discussion and his helpful suggestions concerning my manuscripts. I also would like to thank Dr. R. Masereeuw for the internship at the Nijmegen Centre for Molecular Life Sciences and the excellent support concerning experiments, discussion of results and manuscripts.

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Published 01 January 2006
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Language English
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DISSERTATION






submitted to the
Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics
of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany
For the degree of
Doctor of Natural Sciences










presented by
Valeska Reichel, Pharmacist
born in Bremen, Germany














Oral examination: 13.02.2006
























































Molecular and Functional Analyses of Transport Proteins
for Organic Anions






























Referees: Prof. Dr. Gert Fricker
Prof. Dr. Ulrich Hilgenfeld




















Acknowledgements

Special thanks go to Prof. Dr. G. Fricker for the interesting research subject, the support and
the interesting discussions.

I would like to thank Prof. Dr. U. Hilgenfeld for the second opinion and Prof. Dr. J.
Reichling and Prof. Dr. U. Massing for beeing members of my defense committee.

My gratidude goes to Dr. D.S. Miller for an interesting research period at the Mount Desert
Island Biological Laboratory, the active discussion and his helpful suggestions concerning my
manuscripts.

I also would like to thank Dr. R. Masereeuw for the internship at the Nijmegen Centre for
Molecular Life Sciences and the excellent support concerning experiments, discussion of
results and manuscripts.

Special thanks go to Johannes Bartsch who always gave me support and affection and
helped me with all computer problems.

I would like to thank all the colleagues at the department of Pharmaceutical Technology of
the University of Heidelberg, the MDIBL and the NCMLS for the good working climate and
their support, special thanks go to Melanie Ott for the helpful discussions and the cordial
friendship.

Thanks to Boehringer Ingelheim Fonds and Erwin Riesch Stiftung for the scolarships.

Last but not least my thanks go to my parents who always believed in me.



















Parts of this thesis were presented in:

Reichel V., Masereeuw R., Van den Heuvel J.J.M.W., Miller D.S., Fricker G.: Transport of a
fluorescent cAMP analog by Multidrug Resistance-associated Proteins MRP2 (ABCC2) and
MRP4 (ABCC4). American Journal of Physiology: Comparative Physiology: Submitted

Reichel V., DiPasquale K.D., Miller D.S., Fricker G.: Texas Red Transport in Rat and Shark
Choroid Plexus: A Comparison. American Journal of Physiology: Comparative Physiology:
Submitted

Reichel V., Baehr C.H., Fricker G.: Expression, Localization and Functional Analyses of P-
Glycoprotein at the Choroid Plexus. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology:
2004; 369: Supplement 1

Reichel V., Miller D.S., Masereeuw R., Fricker G.: Functional Analyses of Multidrug
Resistance Protein 4 (Mrp4) in renal proximal tubules. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of
Pharmacology: 2005; 371: Supplement 1

Reichel V., DiPasquale K.D., Miller D.S., Fricker G.: Transport of a fluorescent cAMP
analog in killifish, Fundulus heteroclitus, renal proximal tubules. The Bulletin, MDI
Biological Laboratory: 2005, V. 44, 114-115

Posters
Reichel V., Baehr C.H., Fricker G.: Expression, Localization and Functional Analyses of P-
Glycoprotein at the Choroid Plexus. 45. DGPT Spring Meeting, Mainz: 2004

Reichel V., Miller D.S., Masereeuw R., Fricker G.: Functional Analyses of Multidrug
Resistance Protein 4 (Mrp4) in renal proximal tubules. 46. DGPT Spring Meeting, Mainz:
2005

Reichel V., DiPasquale K.D., Miller D.S., Fricker G.: Texas Red Transport in Intact Rat
Choroid Plexus. VIth Conference on Cerebral Vascular Biology, Münster: 2005

Invited Lectures
Reichel V.: Texas Red Transport across Choroid Plexus Epithelium. IIIth Transporter meeting
of the pharmaceutical industry, Ingelheim: 2005







































Zusammenfasssung
Reichel, Valeska, Apothekerin, Tag der mündlichen Prüfung: 13.02.06
Molekulare und funktionelle Charakterisierung von Transportproteinen für Organische
Anionen
Referent: Prof. Dr. Gert Fricker, Koreferent : Prof. Dr. Ulrich Hilgenfeldt
Die Blut-Cerebrospinalflüssigkeit (CSF)-Schranke (BCSFS), wird von den Choroid Plexūs
(CP) gebildet und stellt zusammen mit der Blut-Hirn-Schranke eine wichtige Barriere
zwischen Blut und Gehirn dar. Da die BCSFS nur für kleine, lipidlösliche und ungeladene
Moleküle durchlässig ist, ist es von besonderem Interesse, aktive Transportprozesse für
geladene Substanzen in diesem Gewebe zu untersuchen, da viele ZNS-Wirkstoffe und
Wirkstoffkandidaten Substrate aktiver Transportproproteine sind. Transportprozesse im CP
ähneln denen im proximalen Tubulus der Niere. Deshalb wurden vergleichende Experimente
mit verschiedenen Modell-Anionen mit isoliertem proximalen Nierentubulus des Killifisch
und mit CP von Ratte und Dornhai durchgeführt.
• Zunächst wurde der Transport des fluoreszierenden cAMP-Analogons fluo-cAMP
untersucht: Inhibitorstudien legen den Transport von fluo-cAMP durch die Exportproteine
Mrp2 und Mrp4 nahe. Im Gegensatz zum Transport des Mrp2-Substrates Fluorescein-
Methotrexat (FL-MTX) wird der Transport in der Niere nicht durch die Proteinkinasen A
(PK) A und C (PKC) reguliert. Zur besseren Charakterisierung der kinetischen Parameter
wurde der Transport von fluo-cAMP in Membranvesikeln aus MRP2 bzw. MRP4
überexprimierenden Zellen untersucht. Beide MRPs transportieren fluo-cAMP mit gleich
hoher Affinität. Anders als in der Niere scheint Mrp4 im CP nicht am Transport von fluo-
cAMP beteiligt zu sein, allerdings geben Inhibitionsexperimente mit konkurrierenden
selektiven Substraten Hinweise für eine Beteiligung von Mrp1. Die Regulation des
Transportes von fluo-cAMP im Ratten-CP erfolgt nicht über PKA, PKC oder die Mitogen-
aktivierte PK (MAPK).
• Der Transport von Texas Red (TR) und FL-MTX wurde im CP der Ratte und des Dornhais
untersucht. TR wird durch Ratten-CPs in einem zweistufigen Prozess transportiert, der
+Metabolismus-getrieben, Na -abhängig, potentialunabhängig und auch unabhängig von
+Mrp1, Mrp2 und Mrp4 ist. Im Hai ist der Transport von TR Na -unabhängig, wobei die
Aufnahme über ein Oat-Protein zu erfolgen scheint, während der basolaterale Efflux
mutmasslich über das Oatp2-Protein und Mrp1 erfolgt.
+• Die apikale Aufnahme von FL-MTX im Ratten-CP ist ebenfalls Na -abhängig, der
basolaterale Efflux ist potentialunabhängig und erfolgt wahrscheinlich auch über Mrp1 und
Oatp2. PKA-Aktivierung führt zu einer Aktivierung des FL-MTX Effluxes. Im Dornhai
wird FL-MTX durch die gleichen Transportproteine transportiert. Im Gegensatz zur Ratte
führt eine PKA-Aktivierung zu einem reduzierten Efflux von FL-MTX, während PKC-
Aktivierung zu einer Herabregulierung des Transports von FL-MTX führte.