Molecular Biology Techniques Applied to Food Industry Water Surveillance [Elektronische Ressource] / Jessica Varela Villarreal. Betreuer: U. Obst

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Molecular Biology Techniques Appliedto Food Industry Water Surveillancezur Erlangung des akademischen Grades einesDOKTORS DER INGENIEURWISSENSCHAFTEN (Dr. -Ing.)der Fakult at fur Chemieingenieurwesen und Verfahrenstechnikdes Karlsruher Institut fur Technologie (KIT)genehmigteDISSERTATIONvonDipl. Biochem. Jessica Varela Villarrealaus MexikoReferent: Prof. Dr. rer. nat. Ursula ObstKorreferent: Prof. Dr. rer. nat. Christoph SyldatkTag der mundlic hen Prufung: 10.06.2011AcknowledgmentsI would like to express my deepest gratitude to my Ph.D. supervisor, Prof. Dr. UrsulaObst, for her assistance and support as for giving me the possibility to carry out my Ph.D.project at the Institute of Functional Interfaces (IFG) at KIT Campus Nord. I am alsograteful to Prof. Dr. Syldatk from the Chair of Technical Biology of the Department ofChemical Engineering at KIT Campus Sud for taking over the co-reference of this work.I want to specially thank Dr. Thomas Schwartz for his guidance and patience, for hishelpful advices and discussions, and for his constant motivation and engagement.I thank all my colleagues at the institute for the friendly atmosphere. My specialthanks to Dr. Christina Jungfer for her constant support and motivation since the verybeginning. I also thank Dr. Jacqueline Su , Dr. Nikolai Stankiewicz, Anja Karolewiez,Mareike Marten and Silke Kirchen for their advices and suggestions, and for their friend-ship.

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Published 01 January 2011
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Molecular Biology Techniques Applied
to Food Industry Water Surveillance
zur Erlangung des akademischen Grades eines
DOKTORS DER INGENIEURWISSENSCHAFTEN (Dr. -Ing.)
der Fakult at fur Chemieingenieurwesen und Verfahrenstechnik
des Karlsruher Institut fur Technologie (KIT)
genehmigte
DISSERTATION
von
Dipl. Biochem. Jessica Varela Villarreal
aus Mexiko
Referent: Prof. Dr. rer. nat. Ursula Obst
Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Christoph Syldatk
Tag der mundlic hen Prufung: 10.06.2011Acknowledgments
I would like to express my deepest gratitude to my Ph.D. supervisor, Prof. Dr. Ursula
Obst, for her assistance and support as for giving me the possibility to carry out my Ph.D.
project at the Institute of Functional Interfaces (IFG) at KIT Campus Nord. I am also
grateful to Prof. Dr. Syldatk from the Chair of Technical Biology of the Department of
Chemical Engineering at KIT Campus Sud for taking over the co-reference of this work.
I want to specially thank Dr. Thomas Schwartz for his guidance and patience, for his
helpful advices and discussions, and for his constant motivation and engagement.
I thank all my colleagues at the institute for the friendly atmosphere. My special
thanks to Dr. Christina Jungfer for her constant support and motivation since the very
beginning. I also thank Dr. Jacqueline Su , Dr. Nikolai Stankiewicz, Anja Karolewiez,
Mareike Marten and Silke Kirchen for their advices and suggestions, and for their friend-
ship. I am also grateful to my desk colleague Markus Geis for being always so kind to
me.
For the nancial support of this work I would like to thank the European Union
PathogenCombat Project and the Institute of Functional Interfaces (IFG) at KIT Campus
Nord.
I am grateful to Johannes Knoll for his experimental input throughout the project, for
the shared hours in the lab and for giving me the opportunity to teach.
My very special thanks to Carla Calder on Rosas and Marcelo Gonzalez for their friend-
ship, their presence and for all the nice moments. Special thanks to my friends Ivana
Magario and Hern an Santa Cruz, for their support on CVT. I would like to thank Nora,
Martin, Jana, Caro, Feli and all my friends, for making me feel a little closer to my home.
I am also eternally grateful to my family.
Agradezco especialmente a mis padres Lidia y Jorge por creer en mi, por apoyarme
incondicionalmente y por haberme dado todo el amor del mundo. A mis hermanitos Fer
y Tincho por su eterno carino~ y dulzura y por ser muchas veces mi inspiraci on.
iiiA mis abuelos por su carino~ in nito y por la maravillosa familia que me dieron.
A la Mamina, a mis suegros Norma y Ricardo, y a mis cunados~ Julio y Silvia por el
apoyo, las fuerzas, la motivaci on, las buenas ondas y el gran carino~ que me dan.
Por ultimo quiero agradecer a la persona que me motiva desde el principio, a mi amor
Riqui. Por su apoyo incondicional, por su insuperable paciencia, por comprenderme y
contenerme en los momentos mas d ciles y por hacer que todos los d as sean especiales.
ivZusammenfassung
Mit Hilfe molekularbiologischer und damit kultivierungsunabh angiger Methoden wurden
pathogene Bakterien in Trinkwasser an hygienekritischen Kontrollpunkten entlang der
Fertigungsstrecke eines deutschen Molkereiunternehmens und eines spanischen Betriebes
fur Rohschinken nachgewiesen. Mit der denaturierenden Gradienten - Gelelektrophorese
(DGGE) konnten Ver anderungen in der bakteriellen Population beschrieben werden,
welche die biologische Instabilit at in Trinkwasser und in Bio lmpopulationen aufzeigen.
Autochthone Bakterien konnten durch Sequenzierung von DNA - Banden aus DGGE -
Gelen identi ziert werden. Fur genauere Untersuchungen wurden PCR und qPCR einge-
setzt, um eine Anzahl pathogener Bakterien (d.h. Listeria monocytogenes, Mycobac-
terium avium subsp. paratuberculosis, Campylobacter jejuni, Enterococcus spp., Salmo-
nella spp., Escherichia coli, und Pseudomonas aeruginosa) nachweisen zu k onnen.
Eine spezi sche Strategie wurde entwickelt, um hygienekritische Kontrollpunkte in den
Lebensmittelbetrieben zu ermitteln zu k onnen, an denen die technischen Voraussetzungen
fur Nachweise und die Erfassung und Vermeidung unerwunsc hter Polymerase - Inhibitoren
betrachtet wurden.
Die Populationen autochthoner Bakterien an den meisten Trinkwasser-Kontrollpunkten
stellten sich als au e rst stabil heraus. Nur ein Kontrollpunkt des deutschen Molkereiun-
ternehmens zeigte Ver anderungen in der Population. Enterokokken und Pseudomonas
aeruginosa konnten in einigen Wasserproben dieser Unternehmen mit molekularbiolo-
gischen Methoden nachgewiesen werden, nicht jedoch mit den herk ommlichen Kulti-
vierungsmethoden. Einige opportunistische Bakterien, wie Enterobacter sp., Acineto-
bacter, Sphingomonas sp. und apathogene Bacillus - Arten, wurden durch Sequenzierung
von DNA - Banden aus DGGE - Gelen identi ziert. In dem spanischen Rohschinken -
Unternehmen wurden keine Populationsverschiebungen gefunden, jedoch wurde P. aeru-
ginosa - DNA im Trinkwasser - und Bio lm - Proben detektiert.
DNA - basierte Methoden, die fur den Nachweis und die Charakterisierung von Bakte-
rien in Trinkwasser und in Trinkwasserbio lmen angewandt wurden, k onnen nicht zwi-
schen DNA von lebenden und toten Zellen unterscheiden. Eine Reihe kultivierungsun-
vZusammenfassung
abh angiger Methoden wurden erprobt, um dieses Problem zuosen.l
Es wurden Behandlungen der Proben mit Desoxyribonuclease I (DNase I) oder Pro-
pidiummonoazid (PMA) vor der Untersuchung mit DNA - basierten Methoden getestet,
optimiert und verglichen, um lebende von toten Bakterien in Trinkwasser und in Bio l-
men unterscheiden zu k onnen.
Die Vorbehandlung mit Desoxyribonuclease I / Proteinase K (DNase/PK) wurde fur
den Verdau von freier DNA und DNA von toten Zellen mit gesch adigten Zellmembranen
optimiert. Da diese Methode fur den Nachweis von Bakterien im Trinkwasser verwen-
det werden soll, wurden verschiedene Membran lter zur Aufkonzentrierung der Biomasse
aus den Wasserproben getestet. Untersucht wurde, ob die Membran lter die DNase/PK -
Behandlung in irgendeiner Weise beein ussen.
Nachdem die DNase/PK - Methode etabliert war, wurde sie mit lebenden und toten
Zellen und mit freier DNA getestet. Dafur wurde eine Mischung aus lebenden Zellen
von S. aureus, toten Zellen von P. aeruginosa und genomischer DNA von S. enterica
hergestellt. Aliquots dieser Mischung wurden vorbehandelt und anschlie end untersucht,
um die verschiedenen Vorgehen zu vergleichen. Die Populationsanalysen der Bakterien
wurde mit Hilfe der PCR - DGGE durchgefuhrt um die Proben ohne Vorbehandlung
(Gesamt - DNA) und mit Vorbehandlung durch DNase/PK oder PMA (DNA lebender
Zellen) zu vergleichen. Kultivierungsmethoden, quantitative PCR mit Sybr Green und 5 -
Cyano - 2,3 - Ditoryltetrazoliumchlorid (CTC)/4’ - 6 - Diamidin - 2 - Phenylindol (DAPI) -
F arbung wurden angewandt, um die F ahigkeit dieser Behandlungen zu veri zieren, dass
ausschlie lich DNA von lebenden Zellen nachgewiesen werden kann.
Im n achsten Schritt wurden die vershiedenen physiologischen Stadien von Bakterien
aus naturlic hen Trinkwasserbio lmen einer Pilotanlage in einem Wasserwerk bestimmt.
Ver anderungen im DNA - Muster, welche nach einer DGGE - Analyse sichtbar wurden,
zeigten: (i) die Anwendbarkeit der Behandlung von PMA und DNase/PK bei der Unter-
suchung naturlic her Bio lme; (ii) dass der Nachweis von DNA toter Bakterien und ex-
trazellul arer DNA durch die Vorbehandlung mit PMA oder DNase/PK erfolgreich unter-
bunden wird; und (iii) dass eine Behandlung mit DNase/PK eine deutlichere Auswirkung
auf die Unterscheidung von lebend und tot hat, aufgrund der gleichm a igen Wirkung des
Enzyms und durch das Wegfallen von Waschschritten w ahrend des Vorgehens.
Diese Arbeit fasst in einer Diskussion die verschiedenen Methoden zusammen, die
fur den Nachweis m oglicher hygienekritischer Kontrollpunkte verwendet wurden, ein-
schlie lich spezi scher Nachweise fur Pathogene in Wasser - und Bio lm - Proben und
viVer anderungen bakterieller Populationen der ausgew ahlten Kontrollpunkte innerhalb
eines Lebensmittelbetriebes. Einige m ogliche zukunftige Anwendungen wurden im Aus-
blick beschrieben.
viiAbstract
Culture - independent techniques were applied and optimized for the detection of patho-
genic bacteria in drinking water at potentially critical control points along the production
lines at a German dairy company and at a Spanish dry cured ham company. Denaturing
gradient gel electrophoresis (DGGE) was used to describe bacterial population shifts
indicating biological instability in drinking water and bio lm samples. Autochthonous
bacteria were identi ed by sequencing the DNA bands excised from the DGGE gels. More
speci cally, polymerase chain reaction (PCR) and quantitative PCR (qPCR) were applied
to detect a number of pathogenic bacteria, i.e. Listeria monocytogenes, Mycobacterium
avium subsp. paratuberculosis, Campylobacter jejuni, Enterococcus spp., Salmonella spp.,
Escherichia coli, and Pseudomonas aeruginosa.
A speci c strategy was established for the detection of possible water - derived critical
control points at the food companies, where the technical detection requirements and the
occurrence of unwanted polymerase inhibitions were contemplated.
Autochthonous bacterial populations were found to be highly stable at most of the
drinking water sampling points. Only one sampling point exhibited population shifts at
the German dairy company at the rst sampling period. Enterococci and Pseudomonas
aeruginosa were detected in some water samples from these companies by molecular bi-
ology detection methods, but not by conventional culturing methods. Some opportunis-
tic bacteria as Enterobacter sp., Acinetobacter, Sphingomonas sp. and non - pathogenic
Bacillus, were also detected after DNA sequencing of DGGE bands. No population shifts
were found at the Spanish dry cured ham company, but DNA of P. aeruginosa was present
in the drinking water and drinking water bio lm samples.
DNA - based methods were used for the detection and characterization of bacteria in
drinking water and in drinking water bio lms. They cannot distinguish between DNA
from live and dead cells. Further culture - independent methods were tested to face this
problematic.
Treatments of the samples with deoxyribonuclease I (DNase I) or propidium monoazide
ixAbstract
(PMA) before their analysis with DNA - based methods were tested, optimized and com-
pared in this work. The inactivation of DNase I gained a great importance in the treat-
ment. After testing di erent inactivation procedures, DNase I was nally inactivated
with proteinase K. These treatments were used in order to detect and analyze only live
bacteria in drinking water and bio lm samples.
The Deoxyribonuclease I/Proteinase K (DNase/PK) treatment was optimized for the
digestion of free DNA and DNA from dead cells with injured cell membranes. Due to
the fact that this technique should be used for the detection of live bacteria present in
drinking water, this protocol was tested in the presence of di erent lter membranes to
investigate if the lter membranes used for the concentration of biomass present in the
water samples altered anyhow the DNase/PK treatment.
Once the DNase/PK protocol was established a test was done with live and dead
bacteria and free DNA. For this, de ned mixtures of live S. aureus, dead P. aeruginosa and
genomic DNA of S. enterica were mixed in a sample. Aliquots of this sample were treated
and then analyzed to compare the di erent procedures. Bacterial population analysis was
done by PCR - DGGE, comparing samples without treatment (total DNA) and samples
treated with DNase/PK or propidium monoazide (DNA from live cells). Cultivation
methods, Sybr Green quantitative qPCR, and 5 - cyano - 2,3 - ditoryl tetrazolium chloride
(CTC)/4’ - 6 - diamidino - 2 - phenylindole (DAPI) staining were used to verify the ability
of the treatments to detect only DNA from live cells. This experiment demonstrated the
usefulness of the DNase/PK method.
The di erent physiological stages of the bacteria present in natural drinking water
bio lm samples from a pilot scale built up at a waterworks were analyzed. Shifts in
the DNA patterns observed after DGGE analysis, demonstrated: (i) the applicability
of PMA and DNase/PK treatment in natural bio lm investigation; (ii) the detection of
DNA from dead bacteria and extracellular DNA (eDNA) could be successfully blocked
by treatment with PMA or DNase/PK; and (iii) DNase/PK treatment demonstrated a
clearer e ect on live/dead di erentiation due to a more homogeneous e ect of the enzyme
and to the absence of washing steps in the procedure.
This work concludes with a discussion about the di erent methods that were used for
the detection of possible water - derived critical control points, including speci c pathogen
detection in water and bio lm samples, and bacterial population shifts of the chosen
sampling points within a food company. Some possible future applications were described
in the outlook.
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