New oxidoreductases for the synthesis of chiral building blocks [Elektronische Ressource] / Nina Richter. Gutachter: Vlada Urlacher. Betreuer: Werner Hummel

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NEW OXIDOREDUCTASES FOR THE SYNTHESIS OF CHIRAL BUILDING BLOCKS Nina Richter Thesis for doctoral degree (Dr. rer. nat.) New oxidoreductases for the synthesis of chiral building blocks Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf vorgelegt von Nina Richter aus Essen Mai 2010 Aus dem Institut für Molekulare Enzymtechnologie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Gedruckt mit der Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Referent: Prof. Dr. W. Hummel Koreferent: Prof. Dr. V. Urlacher Tag der mündlichen Prüfung: 28. Juni 2010 ABSTRACT I ABSTRACT Biocatalytic strategies for the synthesis of versatile chiral building blocks have gained increasing interest over the past few decades. Because of the high demand for new enzymes that are capable of catalysing reactions of biotechnological interest, the aim of this thesis was to identify new catalysts that facilitate biocatalytic access to valuable chiral synthons.

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Published 01 January 2011
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NEW OXIDOREDUCTASES FOR THE
SYNTHESIS OF CHIRAL BUILDING BLOCKS

Nina Richter









Thesis for doctoral degree (Dr. rer. nat.)
























New oxidoreductases for the synthesis

of chiral building blocks












Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf







vorgelegt von
Nina Richter
aus Essen





Mai 2010

Aus dem Institut für Molekulare Enzymtechnologie
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf








Gedruckt mit der Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf








Referent: Prof. Dr. W. Hummel
Koreferent: Prof. Dr. V. Urlacher



Tag der mündlichen Prüfung: 28. Juni 2010

ABSTRACT I
ABSTRACT

Biocatalytic strategies for the synthesis of versatile chiral building blocks have gained
increasing interest over the past few decades. Because of the high demand for new
enzymes that are capable of catalysing reactions of biotechnological interest, the aim
of this thesis was to identify new catalysts that facilitate biocatalytic access to
valuable chiral synthons. Using a genome mining approach based on the sequence of
the glycerol dehydrogenase GLD1 from Hypocrea jecorina, three interesting
oxidoreductases were identified. These enzymes were characterised with respect to
their ability to catalyse reactions of biotechnological interest.

Glycerol dehydrogenase from Gluconobacter oxydans (GlyDH): GlyDH
catalyses the enantioselective reduction of aldehydes, as well as the asymmetric
oxidation of different alcohols and sugar alcohols. According to the high
enantioselectivity of GlyDH in the reduction of D-glyceraldehyde, this enzyme can be
applied in the kinetic resolution of rac-glyceraldehyde to produce enantiopure
L-glyceraldehyde on a preparative scale. For this purpose, two different systems
have been constructed and studied comparatively: a cell free-system based on
isolated enzymes (GlyDH and glucose dehydrogenase for cofactor regeneration) and
a constructed recombinant whole-cell catalyst system. In addition, the application of
GlyDH in the regio- and stereoselective oxidation was possible, facilitating the
enantioselective production of different sugars from sugar alcohols.
Moreover, the structure of GlyDH was elucidated by X-ray-crystallography at 2.0 Å
resolution. The crystal structure of GlyDH was used to understand the catalytic
mechanism, the enantioselectivity and the substrate preference of GlyDH on a
molecular level.

Carbonyl reductase from Neurospora crassa (NcCR): NcCR catalyses the
reduction of different carbonyl compounds, in particular, α- and β-ketoesters, to
produce the corresponding hydroxyesters. A feasible process using NcCR under
standard conditions was not possible, but by applying methods of reaction
engineering, a feasible process for the production of α- and β-hydroxyesters was
established.

Enoate reductase from G. oxydans (EnR): EnR catalyses the chemo-, regio- and
stereoselective reduction of C=C double bonds of various activated alkenes. By
II ABSTRACT
applying EnR, different compounds with biotechnological interest, such as
(S)-citronellal and (R)-levodione, were produced.

In summary, three enzymes that catalyse interesting reactions were identified,
cloned, heterologously expressed and successfully applied in the biocatalytic
synthesis of valuable chiral building blocks.



































ZUSAMMENFASSUNG III
ZUSAMMENFASSUNG

Die biokatalytische Synthese wichtiger chiraler Schlüsselbausteinen hat in den letzten
Jahren deutlich an Bedeutung gewonnen. Infolgedessen ist der Bedarf an neuen
Enzymen, die die Synthese solcher Bausteine katalysieren hoch. Ziel dieser Doktorarbeit
war es deshalb, neue Biokatalysatoren zu identifizieren und deren Potential in der
Synthese chiraler Synthons aufzuzeigen.
Zu diesem Zweck wurde ein in silico Screening, ausgehend von der Sequenz der
Glycerol-Dehydrogenase aus dem Pilz Hypocrea jecorina, durchgeführt. Mit Hilfe dieser
Strategie gelang es, drei interessante Oxidoreduktasen zu identifizieren und hinsichtlich
ihrer Anwendung in biotechnologisch relevanten Reaktionen zu untersuchen.

Glycerol Dehydrogenase aus Gluconobacter oxydans (GlyDH): Die GlyDH
katalysiert die enantioselektive Reduktion einer Reihe von Aldehyden, sowie die
asymmetrische Oxidation verschiedener Alkohole besonders Zuckeralkohole. Aufgrund
der hohen Aktivität und Enantioselektivität in der Reduktion von D-Glyceraldehyd konnte
die GlyDH erfolgreich in der kinetischen Racematspatlung von racemischen Glyceraldehyd
eingesetzt werden. Darüber hinaus wurden für die Produktion von L-Glyceraldehyd zwei
alternative Systeme vergleichend untersucht: Ein zellfreies Verfahren basierend auf
isolierten Enzymen (GlyDH und Glucose-Dehydrogenase für die Coenzym-Regenerierung)
und ein rekombinantes Ganzzellsystem. Im weiteren Verlauf der Arbeit konnte ebenfalls
aufgezeigt werden, dass neben der Reduktion auch die Oxidation verschiedener
Zuckeralkohole zu enantiomerenreinen Aldosen katalysiert wird.
Darüber hinaus, gelang es die Struktur der GlyDH röntgenkristallographisch mit einer
Auflösung von 2.0 Å aufzuklären. Die resultierende Kristallstruktur ermöglicht Einblicke in
molekulare Mechanismen, die für den katalytischen Mechanismus, die Enantioselektivität
sowie die Substratspezifität der GlyDH verantwortlich sind.

Carbonyl Reduktase aus Neurospora crassa (NcCR): Die NcCR katalysiert die
Reduktion verschiedener Carbonylverbindungen; besonders α- und β-Ketoester werden
mit hohen Aktivitäten umgesetzt. Da jedoch ein geeigneter Prozess unter
“Standardbedingungen” nicht möglich war, gelang es, mit Hilfe einfacher Methoden des
Reaktionsengineering einen adäquaten Prozess zur Darstellung von α- und
β-Hydroxyestern zu entwickeln.

Enoatreduktase aus Gluconobacter oxydans (EnR): Die EnR katalysiert die chemo-,
regio- und stereoselektive Reduktion von C=C Doppelbindungen verschiedener aktivierter
Alkene. Mit Hilfe der identifizierten EnR gelang es, verschiedene Verbindungen mit hoher
IV ZUSAMMENFASSUNG
biotechnologischer Relevanz wie z.B. (S)-Citronellal und (R)-Levodion selektiv und
enantiomerenrein zu synthetisieren.

Insgesamt lässt sich festhalten, dass im Rahmen dieser Arbeit, drei Enzyme mit
biotechnologischer Bedeutung identifizieren, klonieren und heterolog exprimiert werden
konnten. Des Weiteren konnten diese Enzyme erfolgreich in der Synthese hochwertiger
Schlüsselbausteinen eingesetzt werden und somit deren Potential für eine Anwendung in
biotechnologischen Prozessen demonstriert werden.
































LIST OF PUBLICATIONS V
LIST OF PUBLICATIONS


Richter, N., Neumann, M., Liese, A., Wohlgemuth, R., Eggert, T., Hummel, W.
(2009). Characterisation of a new recombinant NADP-dependent glycerol
dehydrogenase from Gluconobacter oxydans and its application in the production of
L-glyceraldehyde, ChemBioChem 10, 1888-1896

Richter, N., Neumann, M., Liese, A., Wohlgemuth, R., Weckbecker, A., Eggert, T.,
Hummel, W. (2010). Characterization of a whole-cell catalyst co-expressing glycerol
dehydrogenase and glucose dehydrogenase and its application in the synthesis of
L-glyceraldehyde. Biotechnol. Bioeng. 106, 541-552

Richter, N., Breicha, K., Hummel, W., Niefind, K. (2010) The three-dimensional
structure of AKR11B4, a glycerol dehydrogenase from Gluconobacter oxydans
reveals a tryptophan residue as an accelerator of the reaction turnover. J. Mol. Biol.
404, 353-362

Richter, N., Gröger, H., Hummel, W., (2011) Asymmetric reduction of activated
alkenes using an enoate reductase from Gluconobacter oxydans. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 89, 79-89

Richter, N., Zienert, A., Hummel, W. (2011). A single point mutation enables lactate
+ +dehydrogenase from Bacillus subtilis to utilize NAD and NADP as Cofactor. Eng. Life
Sci. 11, 26-36

Kraußer, M., Winkler, T., Richter, N., Dommer, S., Fingerhut, A., Hummel, W.,
Gröger, H. (2011) Combination of C=C bond formation via Wittig reaction and
enzymatic C=C bond reduction in a one-pot process in water. ChemCatChem 3, 293-
296

Richter, N., Hummel, W. (2011). Enzyme-catalyzed enantioselective reduction of α-
and β-ketoesters by NADP-dependent carbonyl reductase from Neurospora crassa.
Enzyme Microb. Tech. in press (doi: 10.1016/j.enzimctec.2011.02.004)

Neumann, M., Richter, N., Eggert, T., Hummel, W., Wohlgemuth, R., Liese, A.
(2011) Preparative enzymatic production and isolation of L-Glyceraldehyde.
Submitted



PATENT APPLICATIONS

Richter, N., Hummel, W., Eggert, T., Liese, A., Neumann, M. (2009).
Alkoholdehydrogenase aus Gluconobacter und deren Verwendung. Patent DE 10
2009 007 272.1 (evocatal GmbH)









VI LIST OF PUBLICATIONS
POSTER PRESENTATIONS

Neumann, M., Richter, N., Hummel, W., Eggert, T., Wohlgemuth, R., Liese, A.
(2008). Production of dihydroxyacetone and glyceraldehyde in enzymatic
redoxreactions. Biocat 2008, Hamburg, Deutschland

Richter, N., Neumann, M., Liese,A., Wohlgemuth, R., Eggert, T., Hummel, W.
(2009). Production of L-glyceraldehyde by a new NADP-dependent glycerol
dehydrogenase from Gluconobacter oxydans. Biotrans 2009, Bern, Schweiz

Kraußer, M., Richter, N., Winkler, T., Hummel, W., Gröger, H., (2010). Combination
of a Wittig reaction with an enzymatic C=C-reduction in an one-pot two-step
synthesis of saturated ketones in aqueous media. EuChemMS 2010, Nürnberg,
Deutschland