Novel biocatalysts for technical application by evolution and design [Elektronische Ressource] / von Thorsten Eggert
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Novel biocatalysts for technical application by evolution and design [Elektronische Ressource] / von Thorsten Eggert

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Novel biocatalysts for technical applications by evolution and design Habilitationsschrift zur Erlangung der Venia legendi für das Fachgebiet Molekulare Mikrobiologie an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf von Dr. rer. nat. Thorsten Eggert Dezember 2006 Für Barbara und Laila Th. Eggert Table of contents Table of contents 1. Zusammenfassung 1 2. General introduction 5 3. Scope and objectives 7 4. Biocatalyst identification by high-throughput screening and 9 selection systems 4.1 Introduction 9 4.2 High-throughput screening of chiral alcohols 12 4.3 Spectrophotometric screening assay for hydroxynitrile lyase activity 14 4.4 Screening and selection systems for C-C-bond forming enzymes 16 4.5 Discussion 19 5. Biocatalyst production in Bacillus subtilis 21 5.1 Introduction 21 5.2 Optimization of heterologous protein secretion by signal sequence 24 screening 5.3 Optimization of heterologous protein secretion by directed evolution 28 5.4 Discussion 29 6. Novel biocatalysts by evolution and design 33 6.1 Introduction 33 6.2 First generation of directed evolution: complete saturation mutagenesis 39 6.

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Published 01 January 2006
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Language English
Document size 22 MB




Novel biocatalysts for technical applications by
evolution and design






Habilitationsschrift zur Erlangung
der
Venia legendi
für das Fachgebiet
Molekulare Mikrobiologie
an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf





von

Dr. rer. nat. Thorsten Eggert







Dezember 2006


















































Für Barbara und Laila




Th. Eggert Table of contents
Table of contents


1. Zusammenfassung 1

2. General introduction 5

3. Scope and objectives 7

4. Biocatalyst identification by high-throughput screening and 9
selection systems
4.1 Introduction 9
4.2 High-throughput screening of chiral alcohols 12
4.3 Spectrophotometric screening assay for hydroxynitrile lyase activity 14
4.4 Screening and selection systems for C-C-bond forming enzymes 16
4.5 Discussion 19

5. Biocatalyst production in Bacillus subtilis 21
5.1 Introduction 21
5.2 Optimization of heterologous protein secretion by signal sequence 24
screening
5.3 Optimization of heterologous protein secretion by directed evolution 28
5.4 Discussion 29

6. Novel biocatalysts by evolution and design 33
6.1 Introduction 33
6.2 First generation of directed evolution: complete saturation mutagenesis 39
6.3 Second generation of directed evolution: in vitro gene-shuffling using 44
multiplex-PCR based recombination
6.4 Theory-assisted evolution of enzyme properties 46
6.5 Discussion 54

7. Outlook 57





I Th. Eggert Table of contents





8. References 59

9. Acknowledgements 69

10. Appendix 71
Publications chapter 4
Publications chapter 5
Publications chapter 6
Curriculum vitae
Publication list



II Th. Eggert 1. Zusammenfassung
Wer uns vor nutzlosen Wegen warnt, Chapter 1:
leistet uns einen ebenso guten Dienst wie derjenige,
der uns den rechten Weg anzeigt.

Heinrich Heine

Zusammenfassung

Die Nutzung von Enzymen als biologische Katalysatoren in der organischen Synthese hat
gerade in den letzten Jahren enorm an Bedeutung hinzugewonnen, da deren hohe
katalytische Effizienz und Selektivität Vorteile bietet. Einige Verbindungen für den Einsatz in
der pharmazeutischen Industrie können aufgrund ihrer Komplexität ausschließlich auf dem
Wege der Biokatalyse hergestellt werden. Ferner ermöglicht die Fähigkeit von
Biokatalysatoren, unter milden Reaktionsbedingungen (neutraler pH-Wert, Temperatur von
20-30°C, Normaldruck) aktiv zu sein den kostenreduz ierenden Einsatz durch geringeren
Energieaufwand beim Einstellen der optimalen Reaktionsbedingungen. Darüber hinaus
kommen Umweltschutzaspekte in Betracht, da oft weniger toxische Nebenprodukte während
der Reaktion entstehen. Aus den vorgenannten Gründen spielt die industrielle, oder auch
Weiße Biotechnologie wie sie heute genannt wird, eine bedeutende Rolle neben der
klassischen chemischen Synthese. Eine Vielzahl von erfolgreichen Beispielen zeigt die
Leistungsfähigkeit von isolierten Enzymen oder ganzen mikrobiellen Zellen bei der Katalyse
zur Herstellung organischer Verbindungen. So ist es beispielsweise möglich, durch
Biokatalyse chirale Bausteine herzustellen, die mit klassischen (Chemo-)Katalysatoren nur
schlecht oder gar nicht zugänglich sind.
Nicht zuletzt aufgrund dieser Leistungsfähigkeit bekannter Enzyme steigt die Nachfrage an
geeigneten neuen Biokatalysatoren in den letzten Jahren rapide an. Eine Herausforderung
an die Weiße Biotechnologie in den kommenden Jahren wird daher die Bereitstellung neuer,
aktiver und stabiler Enzyme für den technischen Einsatz sein. Auch wenn diese Aussage
zunächst trivial erscheint, müssen hierzu neue wissenschaftlich fundierte und technisch
umsetzbare Lösungswege entwickelt werden.
In der vorliegenden Habilitationsschrift werden neue Strategien beschrieben für drei
Teilaspekte zur Bereitstellung neuer Biokatalysatoren: (i) die Identifizierung neuer Enzyme,
(ii) ihre Produktion in mikrobiellen Expressionswirten (iii) sowie ihre Optimierung durch
molekulares Engineering. Das Ziel ist hierbei, ausgehend von einem gewünschten Produkt,
geeignete Biokatalysatoren für die entsprechende Reaktion zu finden, die später sogar in
technische Prozesse eingesetzt werden können (Abb. 1.1).


- 1 - Th. Eggert 1. Zusammenfassung



Ausgangssubstanz Neue Biokatalysatoren Produkt


Identifizieren Produzieren OptimierenA B
(Kapitel 4) (Kapitel 5) (Kapitel 6)



Abb. 1.1: Der Weg von einer gewünschten chemischen Reaktion zum biokatalytischen Prozess erfordert
mehrere Teilschritte. Diese Teilschritte umfassen die Identifizierung, die Produktion sowie die Optimierung der
Biokatalysatoren, wie es in den Kapiteln 4 bis 5 in dieser Arbeit beispielhaft an ausgesuchten Modellenzymen und
organismen beschrieben wird.


In Kapitel 4 der Arbeit werden die Probleme bei der Identifizierung neuer enzymkodierender
Gene thematisiert. Am Beispiel von drei verschiedenen Reaktionstypen wird die Entwicklung
von Hochdurchsatz-fähigen Screening Methoden beschrieben. Ein gekoppelter Enzymtest,
bei dem enantioselektive (R)- und (S)-spezifische Alkoholdehydrogenasen sowie Diaphorase
verwendet wird, konnte zum Nachweis chiraler Alkohole für einen automatisierten
Hochdurchsatz-Assay entwickelt werden. Reproduzierbare Messungen der Enantiomeren-
überschüsse (ee) konnten bei der durch Lipase katalysierten Esterhydrolyse bis in den μM-
Bereich erfolgen. Weiterhin wurden spektrophotometrische Assays für die Identifizierung
neuer Hydroxynitril Lyasen und Benzoylformiat Decarboxylasen entwickelt. Beide
Enzymklassen katalysieren für die organische Synthese interessante C-C-Verknüpfungs-
Reaktionen. Darüber hinaus wird ein Wuchsselektions-System auf Basis eines
Pseudomonas putida Stammes beschrieben, das zur Durchmusterung sehr umfangreicher
Expressions-Bibliotheken (Genom-, Metagenom-, Zufallsmutagenese-Banken) eingesetzt
werden kann, um neue Benzoylformiat Decarboxylasen sowie andere Enzymklassen, deren
Aktivität zur auf Freisetzung von Benzaldehyd führt, zu identifizieren.
Der zweite Themenkomplex, der sich an die Identifizierung neuer Enzym-Gene anschließt,
ist die Produktion von Biokatalysatoren in mikrobiellen Wirten. Im Kapitel 5 wird dieser
Schwerpunkt aufgegriffen und am Beispiel der Enzymproduktion mit anschließender
Sekretion im Gram-positiven Modellorganismus Bacillus subtilis erörtert. Neben der
Entwicklung neuer Vektoren für die Überexpression und Sekretion in B. subtilis steht vor
allem die Optimierung der Sekretion im Mittelpunkt. Die dargestellten Arbeiten untersuchen
zum ersten Mal systematisch die Bedeutung des N-terminalen Signalpeptides in Bezug auf
die Sekretionseffizienz heterologer Proteine im Modellorganismus. Anhand einer kompletten
Bibliothek der natürlichen B. subtilis Signalpeptide sowie unter Einsatz von Methoden der
gerichteten Evolution wird in der vorliegenden Arbeit eine effiziente Strategie für die
- 2 - Th. Eggert 1. Zusammenfassung
Identifizierung geeigneter Sekretionssignale vorgestellt. Ferner wird anhand eines
abgeleiteten Modells die Hypothese eines „balancierten Gleichgewichts“ aller beteiligten
Komponenten der Sekretionsmaschinerie aufgestellt, wonach je nach Faltungseffizienz des
Targets auf der trans-Seite der Membran zum Teil eine verringerte Translokation /
Prozessierung zu einer Steigerung der Sekretionseffizienz führt. Bisher wurde eine effiziente
Translokation / Prozessierung immer mit einer hohen Sekretionsleistung für das heterologe
Protein gleichgesetzt.
Das dritte Arbeitsfeld, dargestellt in Kapitel 6, umfasst die problembezogene Optimierung
von Biokatalysatoren. Wenn geeignete Enzyme erst einmal identifiziert und schließlich auch
in ausreichender Menge produziert werden können, schließt sich oft die Frage nach einer
dem geplanten biokatalytischen Prozess angemessene Optimierung an. Stabilitäts- oder
Selektivitätsansprüche stehen hierbei meist im Vordergrund. Die gerichtete Evolution, also
die Auslese im Reagenzglas der am besten angepassten Variante nach dem Darwinschen
Prinzip, zählt inzwischen neben dem rationalen Design zu den Standardtechnologien in der
molekularen Optimierung von Biokatalysatoren. In dieser Arbeit werden neue
Mutagenesemethoden vorgestellt, die an ausgewählten Modellenzymen erprobt und den
klassischen Strategien der sog. error prone polymerase chain reaction (epPCR) und dem
DNA shuffling gegenübergestellt wurden. Die komplette Sättigungsmutagenese, gezeigt am
Beispiel der extrazellulären Lipase A aus B. subtilis (BSLA), wird im Rahmen dieser Arbeit
als zuverlässige Mutagenesestrategie für eine erste Generation in der gerichteten Evolution
vorgeschlagen. Für eine zweite Generation, bei der üblicherweise rekombinative Ansätze
zum Einsatz kommen, wird eine technisch einfache und effektive neuentwickelte Methode
auf Basis der Multiplex-PCR vorgestellt und ebenfalls am Beispiel der BSLA auf ihre
Leistungsfähig geprüft.
Zum Abschluss werden zwei Projekte zur Theorie-unterstützten in vitro Evolution
beschrieben, die in Zukunft sicherlich weiter an Bedeutung gewinnen wird, um die
molekulare Optimierung von Enzymen signifikant zu beschleunigen. Rationales Design und
gerichtete Evolution wurden kombiniert, um in die von Natur aus minimale / -Hydrolase
BSLA zusätzliche Domänen einzubringen, ohne das allgemeine Faltungsprinzip zu
zerstören. Durch Computer-Modelling wurden geeignete Positionen im Enzym ausgewählt
und neue Aminosäure-Sequenzen eingefügt. Im Anschluss daran wurden durch gerichtete
Evolution das BSLA-Rückgrat und die neu eingebrachten Domänen aneinander angepasst.
Diese gewissermaßen „rationalisierte“ Evolution erweiterte effektiv die katalytischen
Eigenschaften des zu optimierenden Enzyms. Des Weiteren konnte gezeigt werdem, dass
theoretische Methoden wie QM/MM-Rechnungen in der Lage sind, aufwendige Labor-
Experimente durch Computersimulation zu ersetzen, wodurch Methoden der
Zufallsmutagenese zielgerichteter einsetzt werden können. Ziel ist die Begrenzung des
- 3 -
baTh. Eggert 1. Zusammenfassung

Umfanges der Variantenbibliotheken, was wiederum den Screeningaufwand signifikant
reduzieren hilft. Schließlich führt eine gesteigerte Qualität bei der Erstellung von
Zufallsmutanten-Bibliotheken zu einer Verbesserung der Ausbeute in Optimierungs-
prozessen.



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