Ruminal degradation of ochratoxin A – in vitro investigations at varying rations and rumen microbial populations [Elektronische Ressource] / Muhammad Mobashar. Landwirtschaftliche Fakultät

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Institut für Tierwissenschaften Abteilung Tierernährung der Rheinischen FriedrichWilhelmsUniversität Bonn Ruminal degradation of ochratoxin A – in vitro investigations at varying rations and rumen microbial populations InauguralDissertation zur Erlangung des Grades Doktor der Agrarwissenschaften (Dr. agr.) der Hohen Landwirtschaftlichen Fakultät der Rheinischen FriedrichWilhelmsUniversität zu Bonn Vorgelegt im Juni 2011 Von M. Sc. Muhammad Mobashar aus Haripur, Pakistan Referent: Prof. Dr. K.H. Südekum Korreferent: Prof. Dr. H.W. Dehne Tag der mündlichen Prüfung: 23. 09.2011 Diese Dissertation ist auf dem Hochschulschriftenserver der ULB Bonn http://hss.ulb.unibonn.de/diss_online elektronisch publiziert. Erscheinungsjahr: 2011 Institute of Animal Science Rheinische FriedrichWilhelmsUniversity Bonn Ruminal degradation of ochratoxin A – in vitro investigations at varying rations and rumen microbial populations A dissertation submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Agricultural Science (Dr. agr.) Faculty of Agriculture Rheinische FriedrichWilhelmsUniversity Bonn, Germany Submitted in June 2011 by M. Sc.

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Institut für Tierwissenschaften
Abteilung Tierernährung der Rheinischen FriedrichWilhelmsUniversität Bonn






Ruminal degradation of ochratoxin A – in vitro investigations at
varying rations and rumen microbial populations

InauguralDissertation
zur
Erlangung des Grades
Doktor der Agrarwissenschaften
(Dr. agr.)
der
Hohen Landwirtschaftlichen Fakultät
der
Rheinischen FriedrichWilhelmsUniversität
zu Bonn

Vorgelegt im Juni 2011
Von M. Sc. Muhammad Mobashar
aus Haripur, Pakistan































Referent: Prof. Dr. K.H. Südekum
Korreferent: Prof. Dr. H.W. Dehne

Tag der mündlichen Prüfung: 23. 09.2011

Diese Dissertation ist auf dem Hochschulschriftenserver der ULB Bonn
http://hss.ulb.unibonn.de/diss_online elektronisch publiziert.
Erscheinungsjahr: 2011

Institute of Animal Science
Rheinische FriedrichWilhelmsUniversity Bonn


Ruminal degradation of ochratoxin A – in vitro investigations at
varying rations and rumen microbial populations

A dissertation submitted in partial fulfillment
of the requirements for the degree of
Doctor of Agricultural Science
(Dr. agr.)

Faculty of Agriculture
Rheinische FriedrichWilhelmsUniversity
Bonn, Germany

Submitted in June 2011
by
M. Sc. Muhammad Mobashar
Haripur, Pakistan







Dedicated to my beloved father, Saith Muhammad Yousaf and mother, Khanum
Khan who are no more with me to see the bud of their wishes and prayers
sprouting into a flower

ABSTRACT
Ruminal degradation of ochratoxin A – in vitro investigations at varying rations and rumen
microbial populations

The primary objective of the present study was to evaluate the relative contribution of different
rumen microbial populations (MP) and the effect of ration on degradation of ochratoxin A
(OTA), gas, short chain fatty acids (SCFA) and ammonium production at 24 h incubations using
the Hohenheim gas test (HGT) in vitro fermentation system. Five different HGT rations
(concentrate:roughage ratio (C:R) 10:90, 30:70, 50:50, 70:30 and 90:10) were used, and donor
animals were fed rations with the respective ratios. The rations with the highest concentrate
content were supplied with and without 1% NaHCO (BC) (70:30BC and 90:10BC). The MP 3
included whole rumen fluid (WRF), fungi+protozoa (F+P), bacteria+protozoa (B+P), protozoa
(P) and bacteria+fungi (B+F). Protozoa numbers at 24 h, and OTA and OTα at 4, 8, 12 and 24 h
were quantified. Area under the curve (AUC) and halflife for these ochratoxins were also
calculated. Gas and ammonium production at 4, 8, 12 and 24 h and SCFA production at 24 h
were measured.
The short average OTA halflife for whole rumen fluid of 2.6 h (range 1.34.5 h) demonstrates
the high OTA degradation capacity of the MP (= standard HGT inoculum). MP, ration and their
interaction were found to have significant effects on OTA degradation, gas and ammonium
production. Among MP populations, those with bacteria (B+F and B+P) showed lower AUC
values (p<0.001) for OTA (196673 ng/ml x h) (= higher degradation capacity) and higher gas
production (17.636.8 ml/200 mg DM) than those without bacteria (F+P and P) (7011206 ng/ml
× h and 10.821.4 ml/200 mg DM, respectively). In contrast, MP with P population presented
higher ammonium production. Whole rumen fluid presented the lowest AUC values (146249
ng/ml x h; p<0.05) and higher gas production (22.140.1 ml/200 mg DM). Ration had a quadratic
effect (p=0.001) on protozoa numbers (for B+P, F+P and P). Similarly, MP and ration showed
significant effect on propionate and nbutyrate production while interaction between MP and
ration was only significant for propionate production. Among MP, whole rumen fluid and
populations with bacteria showed higher SCFA production compared to other populations (F+P
and P). It can be concluded that variations in OTA degradation, gas, SCFA and ammonium
production across rations and MP were attributed to particular microbial association with the
highest relevance of bacteria except for ammonium production and relative proportion of
concentrate and roughage with emphasis on moderate level of C:R ratios in ration for OTA
degradation. ZUSAMMENFASSUNG
Ruminaler Ochratoxin A%Abbau –in vitro%Untersuchungen zum Einfluß der Ration und
verschiedener Mikrobengruppen
Das primäre Ziel dieser Arbeit war es, den relativen Beitrag der verschiedenen Populationen
der Pansenmikroben (MP) und die Auswirkungen des Rationstyps auf den Abbau von
Ochratoxin A (OTA), die Gasbildung, den Gehalt an kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) und die
AmmoniumProduktion mittels 24 h Inkubation im Hohenheimer Futterwerttest (HFT) als in
vitro Fermentation System zu bewerten. Es wurden fünf verschiedene HFTRationen
(Kraftfutter:Grobfutter Verhältnis (C:R) 10:90, 30:70, 50:50, 70:30 und 90:10) verwendet,
und das Spendertier für den Pansensaft wurde mit der Ration im jeweiligen Verhältnis
gefüttert. Die Rationen mit dem höchsten Kraftfuttergehalt wurden mit bzw. ohne 1%
NaHCO (70:30BC und 90:10BC) gefüttert. Die MP bestandenem vollständigem Pansensaft 3
(WRF), Pilze + Protozoen (F+P), Bakterien + Protozoen (B+P), Protozoen (P) und Bakterien
+ Pilze (B+F). Die Protozoenzahl bei 24 h und der OTA und OTα Gehalt bei 4, 8, 12 und 24
h wurden quantifiziert. Es wurde weiterhin die Fläche unter der Kurve (AUC) und die
Halbwertszeit für die Ochratoxine berechnet. Gasbildung und Ammonium Produktion bei 4,
8, 12 und 24 h, sowie die SCFABildung bei 24 h wurden gemessen. Die kurze,
durchschnittliche OTA Halbwertzeit für den vollständigen Pansensaft von 2,6 h (Bereich 1,3
bis 4,5 h) zeigt die hohe OTA Abbauleistung (Abbaukapazität) dieser MP (= Standard HFT
Inokulum). Die MP, Ration und deren Wechselwirkungen (Interaktionen) haben einen
signifikanten Einfluss auf den OTAAbbau und die Gas und AmmoniumBildung. Die MP
mit Bakterien (B+F und B+P) zeigten niedrigere AUCWerte (p <0,001) für Ochratoxin A
(196673 ng/ml x h) (= höhere Abbauleistung) und eine höhere Gasproduktion (17,636,8
ml/200 mg TM) als jene ohne Bakterien (F+P und P) (7011206 ng/ml x h bzw. 10,821,4
ml/200 mg TM). Im Gegensatz dazu zeigt die MP mit Protozoen eine höhere Ammonium
Produktion. WRF zeigt die niedrigsten AUCWerte (146249 ng/ml x h, p <0,05) und eine
höhere Gasproduktion (22,140,1 ml/200 mg TM). Die Ration hatte einen quadratischen
Effekt (p = 0,001) auf die Protozoenzahl (für B+P, P+F und P). Ebenso zeigten die MP und
die Ration einen signifikanten Effekt auf die Propionat und nButyratbildung, während eine
Interaktion zwischen MP und der Ration nur für die PropionatProduktion bedeutsam
(signifikant) war. Bei den MP mit vollständigem Pansensaft und den anderen MP mit
Bakterien zeigte sich eine höhere SCFAProduktion im Vergleich zu anderen Populationen
(F+P und P). Es kann gefolgert werden, dass Variationen im OTAAbbau, der Protozoenzahl,
der Gas, SCFA, und AmmoniumProduktion über Futterrationen und MP mit bestimmten
mikrobiellen Kombinationen (Bakterien haben größte Bedeutung), der relative Anteil der ZUSAMMENFASSUNG
Kraftfutter und Grobfutter mit Schwerpunkt auf einem moderaten C:RVerhältnis in der
Ernährung eine Rolle für den OTAAbbau spielen. iCONTENTS
CONTENTS

1. General introduction…………………………………………………………. 1
2. Objectives of thesis…………………………………………………………. 5
3. Ochratoxin A in ruminants% a review on its degradaiotn by gut microbes
and effects on animals…………………………………………... ………….
7
1. Introduction…………………………………………………………………. 9
2. Occurrence of ochratoxin A in ruminant feeds……………………………… 10
2.1. Concentrates……………………………………………………………………. ... 10
2.2. Forages……………………………………………………………………………. 12
3. Degradation of ochratoxin A in ruminants………………………………….. 14
3.1. Principle of enzymatic OTA degradation……………………………………… 14
3.2. Degradation by different microbial populations……………………………… 15
3.3. Degradation by rumen microbes……………………………………………….. 16
3.3.1. OTA degradation by the rumen microbial populations…………………… 16
3.3.2. OTA degradation capacity of different microbial groups………………… 19
3.3.3. Influence of ration composition on OTA degradation……………………... 20
3.3.4. Further aspects of rumen microbial degradation of OTA……………….... 22
4. Systemic occurrence and excretion of OTA in ruminants………………....... 23
4.1. OTA in pre%ruminating ruminants……………………………………………… 23
4.2. OTA in functional ruminants…………………………………………………….. 23
4.2.1. Pathological findings and systemic occurrence……………………………. 27
4.2.2. Excretion via urine and faeces……………………………………………….. 32
4.2.3. Particularities influencing OTA toxicity and degradation in ruminants… 32
4.3. Occurrence of OTA in ruminant tissues (meat) products………………........ 33
4.4. Occurrence and transfer of OTA into ruminant milk………………………… 33
5. Concluding remarks and considerations…………………………………….. 35
iiCONTENTS
6. References and notes………………………………………………………... 36
4. Ochratoxin A degradation – contribution of different microbial
populations and influence of diet……………………………………………
48
1. Introduction…………………………………………………………………. 50
2. Materials and methods……………………………………………………… 51
2.1. Donor animals and feeding regimes……………………………………………. 51
2.2. Samples for Hohenheim gas test……………………………………………...... 52
2.3. Rumen fluid collection and microbial treatments………………………........ 53
2.4. In vitro incubation and sample collection…………………………………...... 57
2.5. Extraction procedure for OTA………………………………………………….. 58
2.6. High performance liquid chromatography analysis………………………. 58
2.7. Parameters computations and statistical analysis……………………………. 59
3. Results……………………………………………………………………….. 61
3.1. Half%life of ochratoxin A and ochratoxin alpha …………………………...... 63
3.2. Area under the curve (AUC) for ochratoxin A and ochratoxin alpha…...... 65
4. Discussion…………………………………………………………………… 67
4.1. General aspects…………………………………………………………………… 67
4.1.1. General methodological considerations…………………………………….. 70
4.1.2. General capacity of rumen fluid for OTA degradation……………………. 71
4.2. General results …………………………………………………………………. 71
4.2.1. Roles of rumen microbial groups.............................................................. 71
4.2.2. Influence of diet……………………………………………………………… 73
5. Conclusions…………………………………………………………………. 74
6. References…………………………………………………………………... 74
5. Relative contribution of different microbial co%cutul res to gas production,
short chain fatty acids and ammonium production from different diets in
78
an in vitro fermentation system……………………………………………….


80
1. Introduction………………………………………………………………….. iiiCONTENTS
81
2. Material and methods………………………………………………………...
2.1. Donor animals and feeding regimes…………………………………………… 81
2.2. Samples for Hohenheim gas test (HGT)………………………………………. 81
2.3. Rumen fluid collection and rumen microbial co%cultures…………………… 81
2.4. Preparation of antibiotic and fungicide solutions……………………………. 82
2.5. Chemical analysis………………………………………………………………… 82
2.5.1. Ammonium%N……………………………………………………………………. 82
2.5.2. Short chain fatty acids…………………………………………………………. 83
2.6. Statistical analysis………………………………………………………………… 83
3. Results……………………………………………………………………….. 84
3.1. Gas production……………………………………………………………………. 84
3.2. Ammonium production…………………………………………………………… 88
3.3. Short chain fatty acids…………………………………………………………….
90
4. Discussion……………………………………………………………………
94
4.1. Gas production and ammonium…………………………………………………
96
4.1.1. Influence of MP and ration…………………………………………………
96
4.1.2. Bacteria+protozoa vs. bacteria+fungi……………………………………….
96
4.1.3. Ammonium contents – effect of protozoa…………………………………..
97
4.2. Short chain fatty acids…………………………………………………………
98
4.3. Influence of NaHCO ……………………………………………………………... 3 99
5. Conclusions…………………………………………………………………
99
6. References……………………………………………………………………
99
6. General conclusions…………………………………………………………...
105
Acknowledgement……………………………………………………………… 108
Curriculum Vitae……………………………………………………………….. 109