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Single molecule spectroscopy on native and reconstituted peridinin-chlorophyll-protein light-harvesting complexes [Elektronische Ressource] / Stephan Wörmke

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Dissertation zur Erlangung des Doktorgradesder Fakultät für Chemie und Pharmazieder Ludwig-Maximilians-Universität MünchenSingle Molecule Spectroscopy on Native andReconstituted Peridinin-Chlorophyll-ProteinLight-Harvesting ComplexesStephan WörmkeausFlensburg2008iiErkl?rungDiese Dissertation wurde im Sinne von §13 Abs. 3 bzw. 4 der Promotionsordnung vom 29.Januar 1998 von Prof. Dr. C. Bräuchle betreut.Ehrenwörtliche VersicherungDiese Dissertation wurde selbstständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet.München, den 23.6.2008Stephan WörmkeDissertation eingereicht am 23.6.20081. Gutachter: Prof. Dr. C. Bräuchle2. Prof. Dr. H. ScheerMündliche Prüfung am 17.7.2008vMeinen ElternCome, my friends,’T is not too late to seek a newer world.Push off, and sitting well in order smiteThe sounding furrows; for my purpose holdsTo sail beyond the sunset, and the bathsOf all the western stars, until I die.It may be that the gulfs will wash us down:It may be we shall touch the Happy Isles,And see the great Achilles, whom we knew.Tho’ much is taken, much abides; and tho’We are not now that strength which in old daysMoved earth and heaven, that which we are, we are;One equal temper of heroic hearts,Made weak by time and fate, but strong in willTo strive, to seek, to find, and not to yield.from Ulysses by Alfred Lord Tennysonvi25ContentsPhotosynthesis1eridininIntro3ductionrophyll1the25SandingleProteinMoleculesChloandPSpectroscopy2.

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Published 01 January 2008
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Language English
Document size 10 MB

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Ludwig-Maximilians-Universität München
Single Molecule Spectroscopy on Native and
Reconstituted Peridinin-Chlorophyll-Protein
Light-Harvesting Complexes
Stephan Wörmke
aus
Flensburg
2008iiDiese Dissertation wurde im Sinne von §13 Abs. 3 bzw. 4 der Promotionsordnung vom 29.
Januar 1998 von Prof. Dr. C. Bräuchle betreut.
Ehrenwörtliche Versicherung
Diese Dissertation wurde selbstständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet.
München, den 23.6.2008
Stephan Wörmke
Dissertation eingereicht am 23.6.2008
1. Gutachter: Prof. Dr. C. Bräuchle
2. Prof. Dr. H. Scheer
Mündliche Prüfung am 17.7.2008
rungErkl?Meinen Eltern
Come, my friends,
’T is not too late to seek a newer world.
Push off, and sitting well in order smite
The sounding furrows; for my purpose holds
To sail beyond the sunset, and the baths
Of all the western stars, until I die.
It may be that the gulfs will wash us down:
It may be we shall touch the Happy Isles,
And see the great Achilles, whom we knew.
Tho’ much is taken, much abides; and tho’
We are not now that strength which in old days
Moved earth and heaven, that which we are, we are;
One equal temper of heroic hearts,
Made weak by time and fate, but strong in will
To strive, to seek, to find, and not to yield.
from Ulysses by Alfred Lord Tennyson
vvi2.1 Photophysics of Single Molecules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.1.1 Dipole Approximation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.1.2 Radiative Properties of an Emitting Dipole . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.1.3 Lifetimes and Decay Rates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.1.4 Frequency Shifts and Spectral Dynamics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.2 Dipole-Dipole Interactions and Energy Transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.2.1 A Dimer Model . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.2.2 Strong Interaction and Excitons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.2.3 Weak and Förster Energy Transfer . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.3 Principles of Fluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.3.1 Excitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.3.2 Fluorescence Emission . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.4 Principles of Single Molecule Microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.5 Experimental Techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.5.1 Confocal Microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.5.2 Wide-field . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.5.3 Comparison . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.1 Oxygenic Photosynthesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.2 Light-Harvesting Antennae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.3 Building Blocks of PCP Antennae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.3.1 Chlorophylls . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.3.2 Peridinin - the Major Pigment in PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.4 Peridinin Chlorophyll Protein (PCP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.4.1 PCP Structure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.4.2 Reconstitution of PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.4.3 Steady-State Spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.5 Energy Transfer Pathways in PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.5.1 Peridinin to Chlorophyll Energy Transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
Sp1ChloIntroSrophyllyProteinMolecules251Contents53ectroscopPhotosynthesisandandinglethe2Peridininduction3.5.2 Chlorophyll to Chlorophyll Energy Transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.6 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1 Reconstitution of PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.1.1 Extraction and Purification of N-domain Apoprotein . . . . . . . . . . . . 43
4.1.2 Materials for Reconstitution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.1.3 Homo- and Hetero-Chlorophyllous Reconstitution . . . . . . . . . . . . . 44
4.1.4 Atomic Coordinates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.2 Sample Preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.2.1 List of Chemicals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.2.2 Preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.2.3 Cover Slips and Silver Island Films . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.3 Ensemble Spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.3.1 Absorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.3.2 Fluorescence Spectra and Lifetimes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.4 Single Molecule Spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.4.1 Confocal Setup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.4.2 Wide-field Setup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.5 Excitation Schemes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.1 Ensemble Spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
5.1.1 Absorption and Circular Dichroism . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
5.1.2 Fluorescence Emission Spectra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.1.3 Excitation Spectra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.1.4 Lifetime and Quantum Yield . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
5.2 Single Molecule Spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.2.1 Native PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
5.2.2 Homo-Chlorophyllous N-PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
5.3 Stepwise Photobleaching . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
5.4 Polarisation-resolved SMS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
5.5 Solvent Effects on Stability . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
5.6 Protein-Pigment Interaction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
5.7 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
6.1 Ensemble Spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
6.1.1 Absorption and Circular Dichroism . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
6.1.2 Fluorescence Emission Spectra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
6.1.3 Excitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
6.2 Energy Transfer between Chlorophylls . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
6.3 Single-Molecule Spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
6.4 Simulation of Chl-Chl Energy Transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
4PCPofHomo-ChloProphyllous6viii75SprophyllousectroscopectroscopyMofContents5CP43N-dsHetero-ChloMethoyandSpsaterial536.5 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
7.1 Metal Nanoparticles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
7.2 Fluorophore Metal Interactions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
7.2.1 Local Field Enhancement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
7.2.2 Metal-Dipole Interaction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
7.2.3 Enhancement of Radiative Rate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
7.3 Single PCP Complexes on SIF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
7.4 Ensemble Characterisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
7.5 Enhancement Mechanism . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
7.6 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
A.1 Source Code . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
A.1.1 Förster Energy Transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
A.1.2 Monte Carlo Simulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
A.2 List of Publications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
A.3 Contributions to Conferences and Seminars . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
A.4 Lebenslauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
121ry7uMismmaofNanostructuresel891118ConclusionsSMetallicContentslaneousixc7APCPBibliographyat10theInterfaceandContentsx