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Structural and biochemical studies of the human DEAD-box helicase Dbp5 and nucleoporin Nup214 involved in mRNA export [Elektronische Ressource] / Holger von Moeller

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Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Ludwig-Maximilians-Universität München Structural and Biochemical Studies of the Human DEAD-box Helicase Dbp5 and Nucleoporin Nup214 Involved in mRNA Export Holger von Moeller aus Leverkusen 2009 Erklärung Diese Dissertation wurde im Sinne von §13 Abs. 3 der Promotionsordnung vom 29. Januar 1998 von Frau Prof. Dr. Elena Conti betreut. Ehrenwörtliche Versicherung Diese Dissertation wurde selbständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet. München, am 28.05.2009 Holger von Moeller Dissertation eingereicht am: 29.05.2009 1. Gutachter Prof. Dr. Elena Conti 2. Gutachter Prof. Dr. Patrick Cramer Mündliche Prüfung am: 30.09.2009 Meinen Eltern Abstract The hallmark of eukaryotic evolution was the development of the nucleus in cells. This compartmentalization requires the nucleocytoplasmic transport of thousands of molecules. The gate into and out of the nucleus is the nuclear pore complex (NPC). One of the molecules that needs to be exported from the nucleus is messenger RNA (mRNA). mRNA associates with proteins in the nucleus forming a r ribonucleoprotein particle (mRNP). mRNPs bind to dedicated transport factors that facilitate movement through the NPC. One protein that associates to mRNPs is the helicase Dbp5, which belongs to the DEAD-box family of RNA helicases.

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Published 01 January 2009
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Language English
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Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Ludwig-Maximilians-Universität München


Structural and Biochemical Studies of the Human
DEAD-box Helicase Dbp5 and Nucleoporin Nup214
Involved in mRNA Export





Holger von Moeller
aus Leverkusen

2009
Erklärung
Diese Dissertation wurde im Sinne von §13 Abs. 3 der Promotionsordnung vom
29. Januar 1998 von Frau Prof. Dr. Elena Conti betreut.


Ehrenwörtliche Versicherung
Diese Dissertation wurde selbständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet.

München, am 28.05.2009



Holger von Moeller


Dissertation eingereicht am: 29.05.2009

1. Gutachter Prof. Dr. Elena Conti

2. Gutachter Prof. Dr. Patrick Cramer

Mündliche Prüfung am: 30.09.2009




















Meinen Eltern

Abstract
The hallmark of eukaryotic evolution was the development of the nucleus in
cells. This compartmentalization requires the nucleocytoplasmic transport of
thousands of molecules. The gate into and out of the nucleus is the nuclear pore
complex (NPC). One of the molecules that needs to be exported from the nucleus is
messenger RNA (mRNA). mRNA associates with proteins in the nucleus forming a r ribonucleoprotein particle (mRNP). mRNPs bind to dedicated transport
factors that facilitate movement through the NPC. One protein that associates to
mRNPs is the helicase Dbp5, which belongs to the DEAD-box family of RNA
helicases. Dbp5 is essential for mRNA export in both yeast and humans. It binds
RNA and is concentrated and locally activated at the cytoplasmic side of the nuclear
pore complex, where it interacts with the cytoplasmic nucleoporin Nup214. In my PhD
work, I have determined the crystal structures of human Dbp5 bound to RNA and
AMPPNP, and bound to Nup214. I designed and performed in vitro assays, which
show that binding of Dbp5 to nucleic acid and to Nup214 is mutually exclusive. The
interactions are mediated by conserved residues, implying a conserved recognition
mechanism. These results suggest a framework for the consecutive steps leading to
the release of mRNA at the final stages of nuclear export. More generally, they
provide a paradigm for how binding of regulators can specifically inhibit DEAD-box
proteins.










Zusammenfassung
Die Entstehung des Zellkerns war eines der wichtigsten Ereignisse in der
Entwicklung der eukaryotischen Zelle. Die daraus resultierende Unterteilung der Zelle
in Zellkern und Zytoplasma erfordert jedoch den Transport von tausenden von
Molekülen in und aus dem Zellkern. Als Schleuse hierfür dient der sogenannte
Kernporenkomplex. Eines der Moleküle, welches aus dem Zellkern exportiert werden
muss, ist die Boten-RNA (mRNA). mRNAs assozieren mit einer Vielzahl
verschiedener Proteine im Zellkern und bilden sog. Boten-Ribonukleoprotein-Partikel
(mRNP). mRNPs interagieren mit bestimmten Transportproteinen, welche die
Bewegung durch den Kernporenkomplex und dadurch den Export aus dem Zellkern
ermöglichen. Eines der Proteine welches mit mRNPs assoziert ist die DEAD-box
Helikase Dbp5, welche in Mensch und Hefe essentiell am Kernexport von mRNAs
beteiligt ist. Dbp5 bindet RNA und liegt konzentriert auf der cytoplasmatischen Seite
des Kernporenkomplexes vor. Hier bindet es an das cytoplasmatischen Nukleoporin
Nup214 und wird durch ein weiteres Protein lokal aktiviert. In meiner Doktorarbeit
habe ich die Kristallstrukturen des menschlichen Dbp5 im Komplex mit RNA und im
Komplex mit Nup214 bestimmt. Zusammen mit in vitro Experimenten konnte ich
zeigen, dass RNA und Nup214 die gleiche Bindungstelle benutzen und sich deren
gleichzeitige Bindung somit ausschliesst. Die für diese Interaktionen entscheidenden
Aminosäuren sind konserviert und implizieren einen ähnlichen Erkennungs-
mechanismus in Mensch und Hefe. Diese Ergebnisse stellen die Grundlage für ein
Modell, indem die letzten Schritte des Kernexportes, welche in der Freigabe der
mRNA enden, zusammengefasst sind. Desweiteren liefern diese Ergebnisse wichtige
Einblicke in den Regulierungsmechanismen von DEAD-box Helikasen.