The well-tempered thrombin [Elektronische Ressource] : a systematic crystallographic and calorimetric study on the thermodynamics of serine-protease inhibition / vorgelegt von Bernhard Baum

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The well-tempered Thrombin A systematic crystallographic and calorimetricy sotnu dthe thermodynamics of serine-protease inhibition Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) Dem Fachbereich Pharmazie der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von Bernhard Baum aus Hameln Marburg/Lahn 2009 Diedieser Arbeit zugrundeliegenden Untersuchungen w urden auf Anregung von Herrn Prof. Dr. Gerhard Klebe in der Zeit von September 2005 sb iApril 2009 am Institut für Pharmazeutische Chemie des Fachbereiches Pharmazie der Philipps-Universität Marburg durchgeführt. Vom Fachbereich Pharmazie der Philipps-UniversiMtaärbt urg als Dissertation angenommen am: Erstgutachter: Prof. Dr. Gerhard Klebe Zweitgutachter: Prof. Dr. Torsten Steinmetzer Tag der mündlichen Prüfung: 28.08.2009 Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht: Tagungsbeiträge A library of serine protease inhibitors to syisctaelmlya tstudy thermodynamic and structural properties of protein-ligand interactions Applications of BioCalorimetry, Juli 2006, (ZSapraagnoizean), Poster selected for oral presentation Binding affinity: More than the sum of its parts?

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Published 01 January 2009
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The well-tempered Thrombin
A systematic crystallographic and calorimetricy sotnu d
the thermodynamics of serine-protease inhibition





Dissertation
zur Erlangung des
Doktorgrades der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)


Dem Fachbereich Pharmazie
der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von

Bernhard Baum
aus Hameln

Marburg/Lahn 2009
Diedieser Arbeit zugrundeliegenden Untersuchungen w urden auf Anregung von Herrn Prof.
Dr. Gerhard Klebe in der Zeit von September 2005 sb iApril 2009 am Institut für
Pharmazeutische Chemie des Fachbereiches Pharmazie der Philipps-Universität Marburg
durchgeführt.











Vom Fachbereich Pharmazie der Philipps-UniversiMtaärbt urg
als Dissertation angenommen am:
Erstgutachter: Prof. Dr. Gerhard Klebe
Zweitgutachter: Prof. Dr. Torsten Steinmetzer


Tag der mündlichen Prüfung: 28.08.2009
Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht:

Tagungsbeiträge

A library of serine protease inhibitors to syisctaelmlya tstudy thermodynamic and structural
properties of protein-ligand interactions
Applications of BioCalorimetry, Juli 2006, (ZSapraagnoizean), Poster selected for oral presentation

Binding affinity: More than the sum of its parts?
Summer School für Medizinische Chemie, September 206, Regensburg, Poster

Understanding Structure-Activity Relationships: Trhmeodynamic and Crystallographic Studies of
Thrombin Inhibitors
Frontiers in Medicinal Chemistry, Joint German-Sws iMseeting on Medicinal Chemistry, März 2007,
Berlin, Poster

Understanding Structure-Activity Relationships: Trhmeodynamic and Crystallographic Studies of
Thrombin Inhibitors
Biophysics of ligand binding to drug targets,0 0M7a,i I2llkirch (Frankreich), Poster

Thermodynamic and crystallographic characterizati onf protein-ligand interactions
International Workshop “Merging Chemical & Bioloagli cSpace”, März 2007, Marburg, Po ster

Understanding Structure-Activity Relationships: Trhmeodynamic and Crystallographic Studies of
Thrombin Inhibitors,
Applications of BioCalorimetry, Juli 2007,U SBAos)t,o nP (oster

Aufsätze
Gerlach, C., Munzel, M., Baum,, BG.erber, H. D., Craan, T., Diederich, W. Ee., &G. K(l2e0b07).
KNOBLE: a knowledge-based approach for the densdig ns yanthesis of readily accessible small-
molecule chemical probes to test protein binAdnignegw. Chem Int Ed Eng 4l 6, 9105-9.


Baum B. ,Mohamed M., Zayed M., GerlachC, Heine, A., HangauerD,. and Klebe, G. (2009)
More than a simple lipophilic contact: A dethaeilremd odtynamic analysis of nonbasic residues in
the S1-pocket of ThrombiJno.u rnal of Molecular Biology ,390, 56-69.


Baum B. , Muley L., Heine, A., HangauDer., and Klebe, G. (2009)
Think twice: Understanding the high potency pohfe nbyisl -methane inhibitors of thrombJionu.r nal
of Molecular Biology, 391, 552-64

Baum, B., Muley L., Smolinski M., Heine A., KlebeH,a ngG.a uaern,d D. (2009)
Non-additivity of Functional Group Contributionn s Priotein-ligand Binding: A Comprehensive
Study by Crystallography and Isothermal Titrataiolonr imCetry.
Journal of Molecular Biology, submitte d













Für meine Familie




Für melancholische Stunden: Was ich lernen möchte
Es gibt so viele Dinge, von denen ein
alter Mann einem erzählen müsste,
solange man klein ist; denn wenn man
erwachsen ist, wäre es selbstverständlich,
sie zu kennen.
Da sind die Sternenhimmel, und ich
weiß nicht, was die Menschen über sie
schon erfahren haben, ja, nicht einmal die
Anordnung der Sterne kenne ich.
Und so ist es mit den Blumen, mit den
Tieren, mit den einfachsten Gesetzen, die
da und dort wirksam sind und durch die
Welt gehen mit ein paar Schritten von
Anfang nach Ende.
Wie Leben entsteht, wie es wirkt in den
geringen Wesen, wie es sich verzweigt
und ausbreitet, wie Leben blüht, wie es
trägt: alles das zu lernen, verlangt mich.
Durch Teilnahme an alledem mich
fester an die Wirklichkeit zu binden, die
mich so oft verleugnet, - dazusein, nicht
nur dem Gefühle, sondern auch dem
Wissen nach, immer und immer, das ist
es, glaube ich, was ich brauche, um
sicherer zu werden und weniger
heimatlos.

Rainer Maria Rilke

Für den Res t: Wer?Wie?Was? Wieso?Weshalb?Warum?
Wer nicht fragt, bleibt dumm.
Tausend tolle Sachen, die gibt es überall zu sehn.
Manchmal muss man fragen um sie zu verstne.h
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG UND AUFGABENSTELLUNG ............................................................. 9
1.1 Wirkstoffdesign ......................................................................................................... 9
1.2 Aufgabenstellung .................................................................................................... 13
1.3 Die Zielstruktur Thrombin ........................................................................................ 14
1.4 Die Inhibitorenserie UB_THR .................................................................................. 16
1.5 Thermodynamik der Protein-Ligand Wechselwirkung.............................................. 20
1.5.1 Enthalpische Bindungsbeiträge .......................................................................................... 24
1.5.2 Entropische Bindungsbeiträge ............................................................................................ 25
1.5.3 Enthalpie-Entropie-Kompensation ...................................................................................... 27
1.5.4 Die Diskussion thermodynamischer Daten ......................................................................... 30
1.5.5 Isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) ............................................................................. 31
1.5.6 Röntgenkristallographisch bestimmte B-Werte als Indikator für dynamische Parameter .. 37
1.5.7 Die Bedeutung thermodynamischer Daten für das strukturbasierte Wirkstoffdesign ......... 39
1.6 Thrombin als Zielmolekül für das Wirkstoffdesign ................................................... 43
1.6.1 Physiologische Grundlagen: Das System der Blutgerinnung [67] ...................................... 43
1.6.2 Medikamentöse antithrombotische Therapie ...................................................................... 47
1.6.3 Forschung nach neuen Antikoagulantien ........................................................................... 51
1.6.4 Ausblick – in vivo veritas ..................................................................................................... 56
2 ERGEBNISSE UND DISKUSSION ........................................................................ 57
2.1 Der Thermodynamische Referenzzustand .............................................................. 57
2.2 Tabellarische Zusammenfassung aller gemessenen Daten .................................... 60
2.2.1 Beurteilung der Datenqualität ............................................................................................. 66
2.3 Diskussion von Enthalpie-Entropie-Kompensation .................................................. 67
2.4 More than a simple lipophilic contact: A detailed thermodynamic analysis of nonbasic
residues in the S1-pocket of Thrombin ........................................................................ 69
2.5 Think twice: Understanding the high potency of bis-phenyl methane inhibitors of
thrombin ...................................................................................................................... 82
2.6 Cooperativity in Ligand Binding ............................................................................... 96
2.7 Untersuchungen zum Protonierungszustand der Inhibitoren ................................. 107
2.8 Kristallstrukturen weiterer Thrombin-Inhibitoren .................................................... 110
2.8.1 Der KNOBLE-Inhibitor MM18 ........................................................................................... 110
2.8.2 Der duale Faktor Xa- und Thrombininhibitor MI-0002 ...................................................... 112
2.8.3 Der Inhibitor MI-0008 ........................................................................................................ 115
2.9 Isothermale Titrationskalorimetrie mit Ligandengemischen ................................... 117
3 SUMMARY AND PERSPECTIVE ........................................................................ 123
4 EXPERIMENTAL PART ................................................................................... 126
4.1 Kinetic Assay ........................................................................................................ 126
4.2 Microcalorimetry (ITC) ........................................................................................... 126
4.3 Crystallography ..................................................................................................... 126
4.3.1 Crystallographic table ....................................................................................................... 129
5 ANHANG ....................................................................................................... 138
5.1 Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................... 138
5.2 Kristallographische Begriffe................................................................................... 139
5.3 Literaturverzeichnis ............................................................................................... 141
5.4 Lebenslauf ............................................................................................................ 141
5.5 Danksagung .......................................................................................................... 152
5.6 Erklärung .............................................................................................................. 153


1 Einleitung und Aufgabenstellung
1.1 Wirkstoffdesign
Die Fortschritte der letzten Jahrzehnte auf allene bGieten der medizinischen, biologischen
und chemischen Forschung liefern uns ein immer präz iseres Bild, welche pathobiologischen
Mechanismen an der Entstehung von Krankheiten betei ligt sind. Selbst für komplexe
Krankheitsbilder wie Diabetes mellitus oder Schizophrenien gelang es den
Lebenswissenschaften, molekulare Angriffspunkte ( Targets) zu identifizieren, von deren
Beeinflussung durch Arzneistoffe Patienten profitireen. Viele dieser Targets sind Enzyme, die
Stoffwechselprozesse beschleunigen oder als Rezepto ren der Informationsweiterleitung
dienen. Die selektive Blockade einzelner zelluläre r oder extrazellulärer humaner Proteine
kann pathologische Stoffwechselzustände positiv ibnefelussen oder bestimmte
krankheitsverursachende Stoffwechselwege ausschalte n. Im Falle von mikrobiologischen
Erregern bedeutet die Inhibierung wichtiger Enzyme häufig die Hemmung ihrer Vermehrung,
so dass diese Targets Angriffspunkt zur Entwicklng neuer Antinfektivai nsd.
Während viele der klassischen Arzneistoffentdeckung en des letzten Jahrhunderts wie
Aspirin®, Penicillin [1]ci so-dPelr atin [2] auf Zufallsbeobachtungen zurück giehsetn ,es heute
möglich, mit Hilfe des Wissens um die molekularen apthogenen Prozesse rational nach
geeigneten Arzneistoffkandidaten zu suchen [3-5]. Dieser Ansatz verlangt eine ausgiebige
Charakterisierung und Validierung des Targets sowie eine chemische Leitstruktur, deren
Optimierung das Ziel der Arzneistoffentwicklung i.s t
Zur Identifikation von Leitstrukturen werden verschiedene Wege verfolgt. Die Testung
riesiger Substanzbibliotheken auf ihre inhibi erWenidrekung (Highthroughput Screening,
HTS ) hat neben einer geringen Erfolgsrate unter 1 % den Nachteil hoher Kosten. Sind
natürliche Inhibitoren oder Substrate Tdaersg ets bekannt, so kann versucht werden, diese
zusammen mit Wissen über den Katalysemechanismus al s potente niedermolekulare
Inhibitoren zu optimieren. Eine weitere Möglich keitst das de-novo design von
Leitstrukturen mit Hilfe von computergestützten Methoden. Das Verfahren des virtual
screening [6 ]setzt idealerweise die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur des Zielproteins
aus der Röntgenkristallographie [7, 8] oder aus N-MDRaten voraus.
Kann eine Kristallstruktur der Leitstruktur im Kolmepx mit dem Enzym gelöst werden, so sind
die affinitätsbestimmenden Interaktionsmuster leicth zu identifizieren. Man nimmt dabei an,
dass sich die beiden Moleküle in dieser als akdteir vg eobunden bezeichneten Konformation
sowohl geometrisch als auch chemisch zueinander komplementär verhalten und dadurch die
Bioaktivität bedingen. Nun kann das Inhibitormlo lsetkrüukturbasiert in Hinblick auf Affinität
9
und Selektivität optimiert werde-n gewöhnlicherweise in einem zyklischen iterativen
Prozess - bbiiss ddiiee vveerrllaannggtteenn pphhyyssiikkoocchheemmiisscchheenn EEiiggeennsscchhaafftteennee rrrreeiicchh tt ssiinndd.
.
Abbildung 1 Designzyklus für die moderne rationelle Entwicklung von Arzneistoffen
Neben Affinität und Selektivität sind für die imnediisczhe Anwendung die orale
Bioverfügbarkeit, metabolische Stabilität ugned Tgoerxiinzität entsecihdende Parameter.
Diese rationallleee SSStttrrraaattteeegggiiieee hhhaaattt iiinnn dddeeennn llleeetttzzzttteeennn JJJaaahhhrrreeennn eeeiiinnniiigggeee wwweeeooorrrtttlllvvvllleee AAArrrzzznnneeeiiissstttoooffffffeee
hervorgebracht (Abbildung 2).
10

Abbildung 2 Beispiele für in wichtigen Indikationen zugeelnea ssArzneistoffe aus dem
strukturbasierten Wirkstoffdesign
Die Zahl möglicher Zielproteine für üznufktige Entwicklungen ist enorm -bedenkt man, dass
vvvooonnn dddeeennn rrruuunnnddd 222222000000000 mmmeeennnsssccchhhllliiiccchhheeennn GGGeeennneeennn gggeeesssccchhhääätttzzzttteee 333000 000000 GGGeeennnppprrroooddduuukkkttteee aaalllsss „„„ druggable“,
also durch Arzneistoffeb eeinflußbar, eingeschätz werden [9]. Die zunehmend auftretende
Resistenz einiger viraler und bakterieller Krankheitserreger gegen gängige Antiinfektiva
erfordert in naher Zukunft d ie Entwicklung neuer Substanzen. Dazu kann das
strukturbasierte Wirkstoffdesign entscheidend beitragen, indem es die Relevanz einzelner
Mutationen für die Biiinnnddduuunnnggg dddeeerrr AAArrrzzznnneeeiiissstttoooffffffeee „„„sssiiiccchhhtttbbbaaarrr“““ mmmaaaccchhhttt... EEEsss bbblllnnneee iiiaaabbbllleeesssooo zzzuuukkküüünnnffftttiiigggeee
Aufgaben zur Erforschung neuer Arzneistoffe, die au f Erfolge der letzten Jarzhehnte
aufbauen können sowie aus den Mißerfolgen lernen können. Entscheidend für ein e schnelle
und effiziente Entwicklung von niedermolekularen Enzymhemmstoffen ist dabei, die
Suchstrategie auf eine solide Datenbasis zu stellen. Neben der statistischen Auswertung
ssoollcchheerr DDaatteenn kkaannnn eeiinnee ggrrooßßee AAnnzzaahhll aann vveerrssttaannddeennee nn BBeeiissppiieelleenn ddeemm medizinischen
Chemiker die nötige Erfahrung vermitteln, um auch intuitiv zielführende Entscheidungen zu
treffen.
Grundlage für die Suche nach Arzneistoffen in silico durch virtual screening ist neben der
kkkooorrrrrreeekkkttteeennn VVVooorrrhhheeerrrsssaaagggeee dddeeerrr BBBiiinnnddduuunnngggsssgggeeeooommmeeetttrrriiieee dddiiieee vvveeerrrlll ääässssssllliiiccchhheee AAAbbbsssccchhhääätttzzzuuunnnggg dddeeerrr
Bindungsaffinität durch scoring-Funktionen. Obwohl diese bereits an vieleTna rgets
eindrucksvoll und erfolgreich genutzt wurden, sind sie noch weit von einer
Standardanwendung entfernt [10.] Grund für die begrenzte Leistungsfähigkeit der scoring-
Algortihmen ist vor allem die Tatsache, dass dDiyneamik des Protein-Inhibitor-Systems
sssccchhhwwweeerrr zzzuuu eeerrrfffaaasssssseeennn iiisssttt... AAAuuuccchhh sssiiinnnddd eeeiiinnniiigggeee gggrrruuunnndddllleeegggeeennndddeee aaaffffffiiinnniiitttääätttsssbbbeeessstttiiimmmmmmeeennndddeee PPPaaarrraaammmeeettteeerrr
unzureichend verstanden, wodurch die verwendeten Mo delle als zu simpel eingeschätzt
werden müssen [11]. Insbesondere ist problematisch, dass zur Vorhergsae von Protein-
Ligand-Wechselw irkungen häufig Ansätze verwendet werden, die auf G ruppenadditivitäten
11